浓集脑脊液中细菌的方法学研究

             作者：闫玲，张润玲，王应芳，李光迪    

【摘要】  　　目的： 探讨浓集急性细菌性脑膜炎患者脑脊液中细菌的方法. 方法： 采用高速离心法浓集脑脊液中的细菌. 将肺炎链球菌，脑膜炎双球菌，流感嗜血杆菌分别加入到蛋白含量不同及白细胞数不同的脑脊液中，在不同离心力下离心，比较脑脊液中蛋白含量及白细胞数量对离心力的影响. 将离心后的上清液和沉淀分别进行培养及细菌涂片，根据培养皿中菌落形成数对细菌计数. 在显微镜下观察离心前后细菌的形态变化. 结果： 离心力为5753 g，离心15 min时，肺炎链球菌，脑膜炎双球菌，流感嗜血杆菌均达到最佳浓集效果；随着脑脊液中蛋白含量的升高，浓集细菌所需离心力也相应增加；白细胞数量不同时，细菌浓集量之间的差异无统计学意义（P＞0.05）；离心力低于或等于5753g的情况下，离心前后细菌的镜下形态保持不变. 离心力大于5753 g时，培养结果阴性，镜下未见完整细菌形态. 结论： 离心不能使浓度低于102/mL的细菌浓集，但采用离心法能使脑脊液中浓度大于等于102/mL的细菌浓集，为临床早期诊断和针对性的提供及时准确的实验室依据.

【关键词】  脑膜炎 细菌性 脑脊髓液 离心法 相对离心力

　　【Abstract】AIM:  To explore a method to enrich bacteria from cerebrospinal fluid (CSF) of patients with acute bacterial meningitis. METHODS: Bacteria from CSF were enriched by centrifugation with high speed. Streptococcus Pneumoniae，Neisseria Meningitidis and Haemophilus Influenzae were respectively added to CSF with different leukocyte and protein concentrations,and centrifuged at different centrifugal force. The supernatant and the sediment were respectively inoculated onto agar plates,10 μL of which was drawn and observed under microscope simultaneously. The number of bacteria was determined quantitatively by colony counts. RESULTS: With the increase of the protein in CSF,the relative centrifugal force（RCF） to enrich pathogenic bacteria was elevated. As the RCF was 5753 g and centrifugalization time was 15 min,effect of enrichment was optimal. When leukocyte concentration was different,there was no significant difference among groups(P＞0.05). When RCF was over 5753g,we could not observe intact bacteria under microscope. CONCLUSION: The bacteria with concentration less than 102/mL in CSF can not be enriched by centrifugalization. Bacteria with concentration more than or equal to 102/mL in CSF can be enriched effectively by means of centrifugation. Improvement of initial detection of bacteria in CSF can provide precise laboratory evidence in time for early clinical diagnosis and adequate treatment.

　　【Keywords】 meningitis,bacterial; cerebrospinal  fluid (CSF); centrifugation；relative centrifugal force(RCF)

　　0   引言
   
　　急性细菌性脑膜炎是常见的急性严重性中枢神经系统细菌感染性疾病，病死率和后遗症发生率高［1］，故其早期诊断问题一直倍受人们关注. 临床诊断细菌性脑膜炎在很大程度上依靠实验室资料，显微镜检查和脑脊液细菌培养至今仍是其决定性的检测方法［2］. 尽管细菌性脑膜炎患者脑脊液中存在细菌，然而大部分就诊患者由于处于发病的早期阶段或早期使用抗生素造成CSF中菌量减少，使得进行病原微生物培养接种标本时很难取到细菌，导致病原体的漏检，由此可见，如何提高CSF检测时细菌的浓度是解决临床早期针对性治疗的关键所在. 本研究我们通过离心的方法浓集细菌，探讨浓集CSF中细菌的最佳离心条件及影响因素.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   三种标准菌株脑膜炎双球菌ATCC13077，肺炎链球菌ATCC49619，流感嗜血杆菌ATCC49247（卫生部临检中心提供）；巧克力培养皿，羊血培养皿（杭州天和微生物试剂有限公司）. TG16-WS台式高速离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司）；CO2培养箱（美国西盟公司）；日本Olympus显微镜(上海力阳实业有限公司). 无菌脑脊液收集于兰州大学第二神经内科、神经外科、儿科，置4℃冰箱中保存备用.

　　1.2   方法

　　1.2.1   菌液的制备   将标准菌株脑膜炎双球菌接种到普通巧克力培养基中，肺炎链球菌接种到羊血培养基中，流感嗜血杆菌接种到加万古霉素的巧克力培养基中，置于CO2培养箱中孵育24～48 h. 刮取培养基上形成的单个菌落于无菌的脑脊液中，根据标准麦氏管，将三种标准菌株依次稀释成体积为2 mL，浓度为104，103，102个/mL的菌悬液.

　　1.2.2   离心   分别取上述制备好的菌悬液1.1 mL于Effendorf管中，置于离心机中在不同离心力（230，518，920，1438，2071，2819，3681，4660，5753，6961，8284 g）及不同离心时间（5,10,15,20 min）下离心. 相对离心力公式：RCF＝11.17（r,n/1000)2,其中，r是从转头轴线到试管中测定位置的厘米数，n是转头转速r/min.

　　1.2.3   培养计数及鉴定   吸取上清液0.9 mL于无菌试管中，与各管底部的沉淀分别定量取0.1 mL于培养基中培养24～48 h，细菌数量根据菌落形成个数来确定（菌落数是取5次计数的平均值）. 取不同离心力作用后上清液与沉淀中的菌液10 μL进行革兰染色，在镜下观察离心后细菌的形态改变.

　　1.2.4   脑脊液中蛋白基质对浓集细菌所需离心力的影响   将三种标准菌株加入到蛋白含量不同（0.3，0.6，1.14，2.46，3.05，3.81，4.62 g/L）的脑脊液中，研究蛋白含量不同对浓集细菌所需离心力的影响.

　　1.2.5   脑脊液中白细胞数量对浓集细菌所需离心力的影响   将三种标准菌株加入到白细胞数量不同（2000，5000，7000，9000个/mm3）的脑脊液中，统计分析白细胞数量不同时细菌浓集量的变化.
   
　　统计学处理: 所有数据用SPSS11.5软件处理. 采用非参数Kruskal-Wallis秩和检验的方法比较同一浓度下三种菌悬液在不同离心作用后细菌浓集数量的变化，及同一离心力作用下白细胞数不同时细菌浓集量变化.

　　2   结果

　　2.1   生长菌落   不同浓度的细菌在培养皿中生长的菌落不一(表1). 

　　表1   不同浓度的细菌在培养皿上生长的菌落数（略）

　　2.2   细菌浓集数量   在正常脑脊液介质中浓度104,103和102个/mL的三种菌悬液在下列离心力作用后细菌浓集数量发生变化，以浓度为102个/mL为例显示，不同离心力作用下，对于同种菌细菌浓集数量之间的差异有统计学意义（P<0.05）. 同时表明5753 g的离心力的作用下，细菌浓集数量最多（表2）. 其他浓度细菌悬液与浓度为102个/mL有类似结果.

　　表2   不同离心力作用下细菌浓集数量（略）

　　2.3   细菌浓集率   5753 g的离心力作用下，离心时间为15 min时，肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌均达到最佳浓集效果. 

　　2.4   脑脊液蛋白量不同时细菌浓集率   在518，2071，5753 g离心力作用下，蛋白含量分别是0.3，0.6，1.14，2.05，3.05，3.81，4.62 g/L的脑脊液中肺炎链球菌、脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌浓集率的变化. 结果显示，相同的离心力作用下，三种菌的浓集率随着脑脊液中蛋白的升高而降低；脑脊液蛋白含量增高时，提高相对离心力，三种菌的浓集率随之增高. 然而，相对离心力为5753 g时，不论蛋白含量怎么变化，三种菌均能达到最佳浓集效果. 

　　2.5   白细胞数量不同时细菌浓集数量   非参数Kruskal-Wallis秩和检验，三种菌变化一致，以脑膜炎双球菌为例说明，同一离心力作用下，白细胞数不同时，细菌浓集数量之间的差异无统计学意义（P＞0.05，表3）.

　　2.6   离心后三种菌镜下形态   离心力低于等于5753 g时，三种菌镜下形态离心后与离心前相流感嗜血杆菌（图1A），肺炎链球菌（图1B，脑膜炎双球菌（图1C）离心前后镜下形态相同.相对离心力为5753 g时，镜下三种菌数量均最多；离心力超过5753 g时，镜下未见完整细菌形态（1D）.

　　表3   白细胞数不同时细菌浓集数量的变化（略）

　　A： 流感嗜血杆菌； B： 肺炎链球菌； C： 脑膜炎双球菌； D： 细菌碎片.

　　图1   细菌状态   革兰染色   ×1000（略）

　　3   讨论
   
　　急性细菌性脑膜炎（即化脓性脑膜炎）是由化脓性细菌引起的中枢神经系统急性感染性疾病，病死率高，存活者神经系统后遗症较多，早期诊断和恰当干预是降低本病死亡率和后遗症发生率的关键［3］. 多种细菌可引起急性细菌性脑膜炎，其中80%以上的病例都是由流感嗜血杆菌，肺炎链球菌和脑膜炎双球菌所引起［4］. 这三种菌引起的化脓性脑膜炎其菌量一般在105～108/mL，然而，由于抗生素的早期使用，使脑脊液培养前病原菌的数量常减少到102/mL左右［5-6］，低浓度的菌量使标本在定量接种时难以取到菌，导致细菌培养结果假阴性，无法为临床提供准确的实验室依据. 本研究发现当细菌的数量减少到102个/mL时，直接接种培养结果为阴性，而在518 g的离心力作用后培养有菌生长，说明通过离心能将细菌浓集. 然而，当细菌的数量减少到10个/mL时，提高离心力也不能使细菌浓集.
   
　　本研究涉及到的三种菌的大小及排列方式不同，肺炎链球菌是直径小于2 μm的球形或卵圆形球菌，可呈链状排列，脑膜炎双球菌直径约为0.6～1.5 μm，流感嗜血杆菌是短小球杆菌，菌体大小1.5 μm×0.3～0.4 μm［7］,其各自特点提示若要达到同样的浓集效果，三种菌所需的离心力可能不同. 本研究表明，在相同的离心力作用下，流感嗜血杆菌浓集的最少，脑膜炎双球菌其次，肺炎链球菌浓集的最多，且同种菌随着离心力的增高浓集的数量也增多，在5753 g的离心力作用下，三种菌均达到最佳浓集效果. 发生细菌性脑膜炎时，脑脊液蛋白质含量显著增高，一般超过0.5 g/L，但低于5 g/L，同时，白细胞数显著增高，高于103/mm3但低于104/mm3.本研究表明，随着脑脊液中蛋白含量的增高，浓集细菌所需的离心力也相应增加，离心力为5753 g，离心15 min时，三种菌均能达到最佳浓集效果.
   
　　综上所述，脑脊液细菌浓度低于10个/mL时，采用离心的方法不能达到浓集细菌的目的，有待于探索更好的浓集方法. 细菌浓度大于等于102个/mL时，采用离心法能够有效的浓集细菌，因为脑脊液蛋白含量增高时能抑制离心浓集细菌，因此选择5753 g作为临床标本离心的首选离心力. 本研究中的三种菌在5753 g的离心力下均达到最佳浓集效果，此离心力是否适用于其他细菌有待于进一步研究.

【】
  　　［1］ 胡亚美,江载芳. 诸福棠实用儿［M］. 7版. 北京：人民卫生出版社，2003，912-926.

　　［2］ Murray PR,Hampton CM. Recovery of pathogenic bacteria from cerebrospinal fluid ［J］. Clin Microbio,1980,4:554-557.

　　［3］ 卢志平,易益芳,胡金平. 56例化脓性脑膜炎临床分析［J］. 国际医药卫生导报,2001,8:50.

　　［4］ 麻 琳，李大年. 化脓性脑膜炎［J］. 医师进修杂志，2002，25（6）：8-10.

　　［5］ Feldman WE. Concentration of bacteria in cerebrospinal fluid of patients with bacterial meningitis［J］. L Pediatr，1976，88:549-552.

　　［6］ Hodges GR,Perkins RL. Acute bacterial meningitis: An analysis of factors influencing prognosis［J］. Am J Med Sci，1977,270:420-440.

　　［7］ 张卓然. 临床微生物学和微生物检验［M］. 3版. 北京：人民卫生出版社，2003:86-178.