抗创伤弧菌mAb的制备与鉴定

【摘要】  　　目的： 制备抗创伤弧菌mAb并用于创伤弧菌感染的快速诊断. 方法： 用灭活创伤弧菌免疫Balb/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗创伤弧菌的mAb,ELISA法用于mAb的Ig效价,亚类及特异性鉴定. 结果： 获得了2株可持续分泌抗创伤弧菌mAb的杂交瘤细胞株. 结论： 获得的高特异性的抗创伤弧菌mAb不仅为创伤弧菌感染的快速诊断奠定了坚实的基础,而且为其进一步的方面的研究提供了理论依据.

【关键词】  弧菌 创伤 抗体 单克隆 杂交瘤

　　【Abstract】AIM： To prepare monoclonal antibody (mAb) against Vibrio vulnificus and evaluate its roles in rapid diagnosis for Vibrio vulnificus infection. METHODS： Balb/c mice were immunized by inactived Vibrio vulnificus. Anti-Vibrio vulnificus McAbs were prepared by using hybridoma technique. The ELISA was used to identify Ig subgroup,titers of ascites,relative affinity and the specificity of McAbs. RESULTS： Two cell lines of hybridoma were established and they  constantly secreted high quality McAbs steadily. CONCLUSION： The McAbs established could be highly specific for Vibrio vulnificus,which not only lays a solid foundation for development of a rapid method for detection of  Vibrio vulnificus infection but also provides the theoretical basis for further investigation of the treatment．

　　【Keywords】  vibrio vulnificus; antibodies,monoclonal; hybridomas

　　0   引言
   
　　创伤弧菌是一种嗜盐弧菌，存在于海水中，广泛存在于海水及海产品中. 人体可通过生食海鲜或经过肢体破损创口接触海水、海产品而受其感染［1-3］，见于海上劳作的渔民及驻海演习人员，常见的是发生下肢创伤弧菌感染所致的脓毒血症，以及败血症引起的内毒素性休克. 创伤弧菌发病特点起病急,死亡率高［4-6］. 因此，快速准确的创伤弧菌早期诊断是指导临床正确用药从而达到理想治疗效果的有力保证；同时，目前对于创伤弧菌的治疗手段仍为经验性的抗生素应用［6-7］. 然而，随着细菌对抗生素逐渐出现的不同程度的耐药现象，找到一种非大剂量应用抗生素的治疗感染也成为亟待解决的问题. mAb用于疾病的诊断及治疗已在医学领域得到广泛开展，并收到了很好的效果. 作为我国海域主要致病菌之一的创伤弧菌，至今未见有诊断与治疗的mAb制剂问世，为了解决该菌感染的诊断及防治问题，本研究对其mAb进行了研究.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   实验所用创伤弧菌标准菌株由第四军医大学解剖学与组织胚胎学教研室黄威权教授惠赠. 骨髓瘤细胞Sp2/O由本室保存. Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量18～20 g，购自第四军医大学实验动物中心. HRP-羊抗鼠I gG购自华美生物工程公司. I g亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司.

　　1.2   方法　

　　1.2.1   抗创伤弧菌mAb的制备   以10 mL/L甲醛溶液灭活创伤弧菌为免疫原，初次免疫后3,5 wk再次免疫，最后一次免疫的第3日取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/O进行融合，间接ELISA法筛选阳性克隆后，有限稀释法进行克隆化，腹水的制备采用常规方法［7］.

　　1.2.2   mAb的鉴定   ①效价测定: 将甲醛灭活过的创伤弧菌菌液稀释至1×1011个/L包被酶标板，分别加入不同浓度稀释的腹水，孵育后加入HRP-羊抗鼠I gG，最后加入OPD显色后，H2SO4终止反应后测A492 nm值. 实验中以免疫的小鼠血清为阳性对照，正常小鼠血清为阴性对照. ②I g亚类鉴定 利用Sigma公司I g亚类鉴定试剂盒检测2株阳性杂交瘤细胞的培养上清. ③相对亲和力检测 用灭活的创伤弧菌菌液以10 mg/L包被酶标板，加入倍比稀释的mAb，孵育后加入HRP-羊抗鼠I gG，OPD显色，H2SO4终止反应后测A492nm值，绘出2条反应曲线，以每条曲线上部平坦段（抗原抗体结合平台期）的A值作为100％，然后以曲线上取得50％A值时的相对应抗体浓度用于比较mAb相对亲和力. ④与其他常见鱼病致病菌的交叉反应实验 分别用灭活的常见鱼病致病菌（鳗弧菌、迟缓爱德华菌、溶藻弧菌、温和气单胞菌及嗜水气单胞菌）包被酶标板，加入小鼠腹水，孵育后加HRP-羊抗鼠IgG,H2SO4终止后测A492nm值.

　　2   结果

　　2.1   杂交瘤细胞系的建立   共进行2次细胞融合，经3次克隆化，获得了2株分泌抗创伤弧菌mAb的杂交瘤细胞系，分别命名为1A2和2D6.

　　2.2   mAb效价和亚类   2株杂交瘤细胞培养上清mAb和腹水mAb效价测定结果表明1A2的培养上清及腹水效价分别高于2D6的培养上清及腹水的效价（表1）. 表明其亲和力与抗体浓度有关（图1）.

　　2.3   mAb相对亲和力   mAb亲和力决定着抗体分子结合簇和抗原决定簇之间立体构型的合适程度. 其高低可以用亲和力曲线来衡量（以不同浓度的mAb为横坐标，不同浓度下测定的A492nm值为纵坐标做出反应曲线，取曲线平坦时的A492nm值为100％，曲线上50％A492nm值相对应的mAb浓度即为该mAb的相对亲和力）. 当mAb亲和力越大，其结合抗原所需的浓度就越低. 结果2株mAb50％A492nm值相对应的浓度：1A2 10-4 mg L，2D6 10-2 mg L；1A2的相对亲和力大于2D6相对亲和力（图1）.

　　图1   mAb的相对亲和力曲线（略）

　　2.4   与其他常见鱼病致病菌的交叉反应实验   2D6与溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌均不产生交叉反应（表2）.

　　表1   mAb的效价和亚类测定结果（略）

　　表2   mAb与常见鱼病致病菌反应性（略）

　　3   讨论
   
　　1970年Roland［8］首先报道由创伤弧菌感染引起的小腿坏疽和内毒素休克以来，世界各地越来越多出现创伤弧菌感染的病例报告［9］. 同样，创伤弧菌也是我国海域主要致病菌［10］. 近年来，国内陆续报道的创伤弧菌感染类型多为脓毒血症. 脓毒血症病死率极高，其致病与创伤弧菌分泌的锌金属蛋白(水解)酶和溶细胞素有关，金属蛋白酶可通过蛋白酶-蛋白酶抑制物引起机体免疫抑制，导致败血症；溶细胞素提高血管内皮细胞内的超氧阴离子水平，促进细胞色素C的释放，激活casp-3，降解聚ADP核酸酶聚合酶和DNA片段，最终引起细胞凋亡［11］.

   
　　创伤弧菌感染导致的严重后果不仅给沿海地区居民的生活和工作带来潜在的威胁，而且对于我军驻海部队作战演习时也同样带来了隐患. 所以，创伤弧菌的早期、准确、快速的诊断对于及时就显得尤为重要；同时，由于细菌对抗生素的耐药现象正在不断升级，有效、安全的治疗措施也是当前临床医护人员面临的一大难题. 以往对细菌的分离鉴定方法较为繁琐，鉴定成本高昂，周期长，难以进行大面积的广泛应用. 而mAb具有的高特异性、高度均质性、来源稳定，可以大量生产、成本低优势克服了传统诊断及防治等方面的缺点.
   
　　本实验通过杂交瘤技术共获得2株分泌抗创伤弧菌mAb的杂交瘤细胞株1A2和2D6.其中，1A2的培养上清及腹水效价分别高于2D6的培养上清及腹水的效价之外，1A2的亲和力同样也大于2D6的亲和力. 然而，从mAb特异性比较的实验结果看，2D6与溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌、鳗弧菌、温和气单胞菌以及嗜水气单胞菌均不产生交叉反应，可以应用于创伤弧菌感染的快速检测. 综上，mAb2D6在快速检测创伤弧菌感染方面具有重要意义，而1A2有望在治疗方面得以进一步的研究. 本实验制备的抗创伤弧菌mAb为开展海上工作人员遇险后快速准确的检测奠定了实验基础，并且为进一步对于创伤弧菌感染治疗的研究提供了理论依据，不仅有着重要的实验意义，而且具有较高的实用价值.

【】
  　　［1］ Colodner R,Chazan B,Kopelowitz J,et al. Unusual portal of entry of Vibrio vulnificus: evidence of its prolonged survival on the skin ［J］. Clin Infect Dis，2002，34（5）：174-175.

　　［2］ Shapiro RL,Altekruse S,Hutwagner L,et al. The role of Gulf Coast oysters harvested in warmer months in Vibrio vulnificus infections in the United States,1988-1996.Vibrio Working Group ［J］. J Infect Dis，1998，178（3）:752-759.

　　［3］ Hlady WG,Klontz KC. The epidemiology of vibrio infections in Florida,1981-1993 ［J］. J Infect Dis，1996，173（5）:1176-1183.

　　［4］ Chuang YC,Yuan CY,Liu CY,et al. Vibrio vulnificus infection in Taiwan: report of 28 cases and review of clinical manifestations and treatment［J］. Clin Infect Dis，1992，15（2）:271-276.

　　［5］ Chang JJ,Sheen IS,Peng SM,et al. Vibrio vulnificus infection-report of 8 cases and reviews of cases in Taiwan ［J］. Changgeng Yi Xue Za Zhi,1994,17（4）:339-346.

　　［6］ 卢中秋,邱巧檬．创伤弧菌脓毒症治疗的研究现状［J］．危重病急救医学,2004，1(5):226-229．

　　［7］ 徐志凯. 实用单可隆抗体技术［M］. 西安:陕西技术出版社:1992,27-102.

　　［8］Roland FP. Leg gangrene and endotoxin shock due to vibrio parahaemolyticus-an infection acquired in New England coastal waters ［J］. N Engl J Med，1970,282（23）:1306.

　　［9］ Bisharat N,Agmon V,Finkelstein R,et al. Clinical,epidemiological,and Microbiological features of Vibrio vulnificus biogroup 3 causing outbreaks of wound infection and bacteraemia in Israel［J］. Lancet，1999，354（9188）:1421-1424.

　　［10］ 吴 玲，张景隆，倪语星，等. 我国沿海地区五省市致病性弧菌的分布及病原学研究［J］. 中华流行病学杂志,1998,19(5):301-303.

　　［11］ 吴 斌，卢中秋．创伤弧菌感染的致病机制研究现状［J］．中国急救医学，2004，24(11)：834-835.