甲氧滴滴涕对小鼠颗粒细胞的毒性损伤及其卵巢组织线粒体的氧化应激机制

               作者：王博，陈必良，马向东，马佳佳 

【摘要】  　　目的： 观察甲氧滴滴涕（MXC）对雌性小鼠颗粒细胞的毒性损伤及其卵巢组织的氧化应激机制. 方法： 将40只雌性昆明小鼠随机分为16,32,64mg/(kg·d)组及溶剂芝麻油组（对照组），连续20天经腹腔注射染毒MXC，末次注射MXC24 h 内处死小鼠，TUNEL法、透射电镜观察卵巢颗粒细胞凋亡情况；激光共聚焦显微镜检测小鼠卵巢线粒体活性氧簇(ROS)、线粒体膜电势，紫外分光光度法检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性变化. 结果： TUNEL法显示32,64 mg/kg组凋亡细胞数(40.87±3.31),（47.12±7.20 ）较16 mg/kg组(14.00±1.85) 及对照组（13.25±1.67）增加，电镜下见凋亡小体等典型凋亡形态学改变，卵巢组织线粒体膜电势，呼吸链复合物Ⅰ活性在32,64 mg/(kg·d)组低于对照组（P<0.01），线粒体ROS水平则较对照组增高（P<0.01）. 结论： MXC可以通过引起卵巢组织的氧化应激诱导颗粒细胞凋亡发挥其促进卵泡闭锁的毒性作用.

【关键词】  甲氧氯 颗粒细胞 细胞凋亡 线粒体 氧化性应激

　　【Abstract】AIM: To investigate the toxic damage of methoxychlor(MXC) on mice granulosa cells and the mechanism of oxidative stress in the ovary tissue. METHODS: MXC was administrated to the 39-day female mice at doses of 0 (control),16,32 and 64 mg/(kg·d) via intraperitoneal injection for consecutive 20 d,then mice were euthanized in estrous. The apoptosis of granulosa cell was observed by TUNEL and transmission electron microscope. The generation of reactive oxygen species(ROS) and the mitochondrial membrane potential of mouse ovary were detected by laser confocal microscope and the activity of respiratory chain complex Ⅰ of mitochondria was measured by an ultraviolet spectrophotometer. RESULTS: The number of apoptotic cells in 32 and 64 mg/(kg·d) groups was obviously higher［(40.87±3.31),（47.12±7.20）］ than that in 16 mg/(kg·d) (14.00±1.85) and control groups（13.25±1.67,P<0.01).  The transmission electron microscopy showed the apoptosis body in 64 mg/(kg·d) group.  The activity of complex Ⅰand the membrane potential of mitochondria were significantly lower in 32 and 64 mg/(kg·d) groups when compared to 16 mg/(kg·d) and control groups（P<0.01）,while the ROS was increased in 32 and 64 mg/(kg·d) groups compared with 16 mg/(kg·d) and control groups（P<0.01）. CONCLUSION: MXC could cause oxidative stress in mitochondria of mouse ovary,which may induce the apoptosis of granulosa cells,and finally follicular atresia.

　　【Keywords】 methoxychlor; granulosa cells; apoptosis; mitochondria; oxidative stress

　　0   引言
   
　　甲氧滴滴涕(MXC)是一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂,体内外研究证实甲氧滴滴涕能够引起雌性大鼠动情周期延长［1］，卵巢萎缩，卵泡闭锁以及降低卵巢组织细胞合成和分泌类固醇激素的能力［2-3］,另有研究表明卵泡闭锁过程中发生的颗粒细胞凋亡通常也可以由氧化应激引起，且这种凋亡可以被超氧化物岐化酶（SOD）、抗坏血酸等氧化应激抑制剂所阻断［4］. 本次实验拟通过对雌性小鼠腹腔染毒MXC,观察其对卵巢组织线粒体氧化应激及颗粒细胞凋亡的影响，探讨MXC对卵巢组织毒性作用的可能机制.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   ①动物： 32日龄雌性昆明小鼠20只购于第四军医大学实验动物中心，体质量32～38 g，自由饮食，饲养温度(22±1)℃，12 h光照－黑暗交替. 经适应性饲养7d后，随机分为对照组,MXC 每日16,32,64 mg/kg 4组，每组5只. 自小鼠39日龄起每日腹腔注射MXC染毒，连续20 d［3,5］. ②试剂与仪器：MXC购自美国Sigma公司（纯度99％，编号：49054），芝麻油为市售纯正芝麻油；甘露醇、蔗糖、EDTA、HEPES及triton X-100均购自北京鼎国生物技术有限责任公司，Bradford蛋白定量试剂盒及活性氧检测试剂盒购于北京普利莱基因技术公司，Rh123、NADH购于碧云天生物技术研究所，TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司，其余试剂为国产分析纯. 台式低温高速离心机(Saitexiangyi tgl-20M),紫外-可见分光光度计（日本岛津UV-2450），激光共聚焦显微镜（奥林巴司,FV-1000），荧光显微镜（Nikon,E-1000）透射显微镜（HITACHI公司,H-600）.

　　1.2 方法

　　1.2.1   颗粒细胞凋亡的检测   末次注射MXC后24 h内脱颈处死小鼠，迅速取出小鼠卵巢，经40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋制成组织切片后，按照TUNEL凋亡试剂盒说明进行颗粒细胞的凋亡检测，结果以荧光显微镜观察并照片，参照［6］进行凋亡细胞计数［6］. 透射电镜观察颗粒细胞的超微结构.

　　1.2.2   卵巢组织线粒体的提取   动物分组及染毒同前,每组5只小鼠待卵巢取出后迅速置于预冷的0℃左右的线粒体提取缓冲液中（225 mmol/L甘露醇，75 mmol/L蔗糖，0.2 mmol/LEDTA,pH7.4）,以眼科剪剪碎后倒入玻璃匀浆器中，上下研磨数十次，制成卵巢组织匀浆并于4℃,700 g离心10 min弃沉淀以去除细胞核、未破碎细胞及非亚细胞组织，上清于7000 g离心20 min后取沉淀并将其悬浮于提取缓冲液中，继续以7000 g离心20 min，重复两次，终沉淀经詹纳斯绿B检验为纯化的线粒体［7］，以上操作均在0～4℃下进行. Bradford蛋白定量试剂盒检测线粒体蛋白浓度，并将其浓度调整为1 mg/mL. 用于测定呼吸链复合体Ⅰ的线粒体蛋白悬液分装后-70 ℃保存,保存时间不超过3 d；线粒体膜电势及活性氧簇的检测则在提取线粒体后立刻进行.

　　1.2.3   线粒体膜电势的检测   将提取出的线粒体10 μL与170μL的测定缓冲液（测定缓冲液的组成为： 15 mmol/L蔗糖,5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L琥珀酸钠,5mmol/L K2HPO4，20 mmol/L HEPES，pH7.4）混合加入96孔培养板内，并加入20 μL Rh123(100 μg/mL)至每孔终体积为200 μL，室温下避光孵育30 min. 以激光共聚焦显微镜在激发波长485 nm,发射波长538 nm处检测各反应混合物荧光强度的变化［8-9］. 当膜电势水平较高时，Rh123将发生淬灭；反之，Rh123在膜电势水平较低时会从线粒体内释放，荧光强度增加，即低水平的膜电势对应较高的Rh123的荧光强度.

　　1.2.4   线粒体活性氧簇（ROS）的检测   取10 μL线粒体与170 μLHEPES缓冲液［缓冲液的组成为（mmol/L）:NaCl,120; KCl,2.5;NaH2PO4,1.2; MgCl2,0.1; NaHCO3,5.0;葡萄糖,6.0;CaCl2,1.0;HEPES,10 at pH7.4］共同加入96孔培养板中，并加入20 μL DCFH-DA (100 μmol/L)至每孔终体积200 μL，37℃避光孵育30 min. 在激发波长485 nm,发射波长530 nm处以激光共聚焦显微镜记录各孔的荧光强度，荧光强度与活性氧水平成正比，增加的荧光强度即被认为是增加的活性氧［8］.

　　1.2.5   线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的检测   将反应体系（0.17 mmol/L NADH,0.6 mmol/L 铁氰化钾，triton X-100 (1mL/L) 溶于50 mmol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，以加入线粒体20 μL作为反应的开始，30℃水浴10 min，以紫外光度计测量各反应杯内NADH在340 nm处的吸光值，单位定义: 每毫克线粒体蛋白每分钟氧化的NADH的nmol数［10］.

   
　　统计学处理：数据采用x ± s表示，数据处理采用SPSS13.0统计软件进行方差分析.

　　2   结果

　　2.1   颗粒细胞凋亡检测结果   TUNEL阳性信号为亮绿色荧光，位于胞核，呈小圆形或环形，32,64mg/(kg·d)组可见较多的阳性信号，且多出现于卵泡的颗粒细胞内(图1A，B))，对照及16 mg/(kg·d)组则较少见到(图1C，D). 凋亡细胞计数结果表明32，64 mg/(kg·d)组较对照组颗粒细胞凋亡增多（P<0.01，表1）. 电镜下,32 mg/kg·d组颗粒细胞排列松散，细胞体积缩小，胞浆内线粒体结构致密，嵴减少甚至消失，并见凋亡小体及染色质边集（↑）等典型凋亡形态学改变（图2A）. 对照组颗粒细胞排列整齐，细胞大小均匀，表面可见微绒毛，胞浆线粒体等细胞器结构清晰，核膜光滑、核仁清晰可见，未见明显病理性改变（图2B）.

　　2.2   MXC对线粒体膜电势的影响   以荧光探针Rh123检测线粒体膜电势水平，结果显示，与正常对照组相比，16 mg/(kg·d) 组未引起线粒体膜电势降低，而在32、64 mg/(kg·d)组则出现明显的Rh123荧光强度的增加，提示该两组线粒体膜电势水平降低（表1）

　　2.3   MXC对活性氧簇生成的影响   结果显示，MXC 32,64 mg/(kg·d)组较对照及16 mg/(kg·d)组活性氧水平明显增加(P<0.01，表1).

　　2.4   MXC对复合物Ⅰ活性的影响   表1可见线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性随MXC剂量增加而逐渐降低，32,64 mg/(kg·d)组酶活性较对照组明显降低，差异有统计学意义（bP<0.01）,16 mg/(kg·d)组未引起明显的酶活性降低（P＞0.05）.

　　A: 64 mg/(kg·d)组;  B: 32 mg/(kg·d)组; C: 16 mg/(kg·d)组,D:对照组.

　　图1   小鼠卵巢组织切片TUNEL染色   ×100（略）

　　A: 32 mg/(kg·d)组； B: 对照组.

　　图2   颗粒细胞的超微结构   ×5000（略）

　　表1   各组小鼠颗粒细胞凋亡数、线粒体膜电势、活性氧及复合物I活性水平（略）

　　aP＞0.05,bP<0.01 vs 对照；MXC:甲氧滴滴涕.

　　3   讨论
       
　　研究表明在正常卵巢的卵泡周期性发育过程中,各期卵泡的闭锁均与颗粒细胞凋亡密切相关［11］,如果卵泡在发育时期发生颗粒细胞凋亡会导致卵泡闭锁，即颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的根本机制. 本次实验中，TUNEL结果显示32,64mg/(kg·d)组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡明显增多，电镜于颗粒细胞内见凋亡小体、染色质边集等典型凋亡性形态改变，由此推测较大剂量的MXC很有可是通过促进颗粒细胞凋亡发挥其诱导卵泡闭锁的毒性作用的.
   
　　线粒体是细胞内产生ROS的最重要的来源之一，且对氧化应激非常敏感，研究明确线粒体内膜的呼吸链是产生ROS的主要来源，当传递链被抑制时ROS的产生会明显增加［9］. 本实验结果表明MXC 32,64 mg/（kg·d）组线粒体复合物Ⅰ活性较对照组明显降低，ROS的产生则高于对照组，推测MXC可能具有复合物Ⅰ抑制剂活性，通过阻抑复合物Ⅰ的电子传递，造成电子逃逸并与细胞内O2反应生成O2-，后者进一步在细胞、组织内代谢生成H2O2,OH-，引起卵巢组织线粒体的氧化应激反应.
       
　　线粒体膜通透性的转变是诱导线粒体发生氧化应激的另一重要因素，当各种原因导致线粒体内膜上的跨膜孔道开放时，离子顺梯度穿过内膜，引起内膜去极化、跨膜电势降低，并影响氧化磷酸化过程导致ROS的产生增加［9］. 而跨膜电位的下降与ROS水平的增加被认为是细胞凋亡级联反应过程中的早期事件，本实验发现32,64 mg/（kg·d）组线粒体膜电势降低，推测MXC能够改变线粒体膜的通透性，导致跨膜电位的降低及ROS产生增加，二者共同促进细胞的凋亡. 已有国内研究表明甲氧滴滴涕能够使卵巢组织中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活力下降,导致组织抗氧化能力降低，自由基产生和清除失衡，引起细胞的氧化应激［12］. 综上所述，MXC能够引起小鼠的卵巢组织发生氧化应激从而促进颗粒细胞的凋亡，这可能是其诱导卵泡闭锁的一个潜在机制. 另有研究证实MXC可以通过不依赖于雌激素水平的Bcl-2和Bax途径抑制卵泡生长，增加卵泡闭锁［4］，因此在卵泡闭锁的机制研究中进一步明确氧化应激与Bcl-2途径间是否存在相互作用仍有待探讨.

【】
  　　［1］ You L,Casanova M,Bartolucci EJ,et al. Combined effects of dieta-ry phytoestrogen and synthetic endocrine-active compound on repro-ductive development in Sprague-Dawley rats: Genistein and methoxy-chlor［J］. Toxicol Sci,2002,66(1):91-104.

　　［2］Zachow R,Uzumcu M. The methoxychlor metabolite,2,2-bis-(p-hydroxyphenyl)-1,1-trichloroethane,inhibits steroidogenesis in rat ovarian granulosa cells in vitro［J］.Reprod Toxicol,2006,22（4）:659-665.

　　［3］ Borgeest C,Miller KP,Gup ta R,et al. Methoxychlor-induced atresia in the mouse involves Bcl-2 family members,but not gonadotropins or estradiol［J］. Biol Reprod,2004,70(6): 1828-1835.

　　［4］Latchoumycandane C,Chitra KC,Mathur PP. The effect of methoxychlor on the epididymal antioxidant system of adult rats［J］. Reprod Toxicol,2002,16(2):161-172.

　　［5］ Borgeest C,Symonds D,Mayer LP,et al. Methoxychlor may cause ovarian follicular atresia and proliferation of the ovarian epithelium in the mouse［J］. Toxicol Sci,2002,68(2):473-478.

　　［6］ 李小飞,张 涛,汪 健,等. 供体犬移植段气管的最佳获取时间［J］. 中华实验外科杂志，2005，22（2）：216-218.

　　［7］ Ghazi-Khansari M,Mohammadi-Bardbori A. Captopril ameliorates toxicity induced by paraquat in mitochondria isolated from the rat liver［J］. Toxicol in Vitro,2007,21(3):403-407.

　　［8］Mao YR,Jiang L,Duan YL,et al. Efficacy of catalpol as protectant against oxidative stress and mitochondrial dysfunction on rotenone-induced toxicity in mice brain［J］. Envir Toxicol Pharmacol,2007,23:314-318.

　　［9］Luo J，Shi R. Acrolein induces oxidative stress in brain mitochondria［J］. Neurochem Int,2005,46(3):243-252.

　　［10］Sen T,Sen N,Jana S,et al. Depolarization and cardiolipin depletion in aged rat brain mitochondria: Relationship with oxidative stress and electron transport chain activity［J］. Neurochem Int,2007,50(5): 719-725.

　　［11］ 严晓南,刘 平,廉 颖，等. 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞和颗粒细胞的影响［J］. 优生与遗传杂志,2006,14(11):102-103.

　　［12］常 飞,陈必良,马向东,等. 甲氧滴滴涕对雌性大鼠血清雌激素水平及卵巢抗氧化系统功能的影响［J］. 第四军医大学学报，2007，28（6）：521-523.