胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性

【摘要】  　　目的： 观察胆汁酸合成增多时，DBP的表达和活性的改变，从整体水平上探讨DBP在胆汁酸合成中的作用. 方法： 给C57BL/6J小鼠T0901317及给Wistar大鼠饲喂高胆固醇食物，两条途径激活肝X受体（LXR），上调CYP7A1的表达增加胆汁酸的合成后，用全自动生化分析仪测定粪胆汁酸，用RT-PCR的方法测定LXR的下游基因胆汁酸合成限速酶CYP7A1，以及DBP的mRNA水平；用Western Blot测定DBP的蛋白水平；用分光光度法测定DBP活性. 结果： LXR被T0901317或高胆固醇食物激活后，CYP7A1的mRNA增加（P<0.05），导致粪中胆汁酸排出增加（P<0.05）的同时，小鼠、大鼠肝DBP的mRNA水平、催化活性以及小鼠的DBP蛋白水平也随之增加（P均小于0.05）. 结论： DBP在整体水平参与了胆汁酸合成并发挥重要作用.

【关键词】  D-双功能蛋白 胆汁酸类和盐类/生物合成 肝X受体 胆固醇7α-羟化酶

　　【Abstract】AIM: To investigate the physiological role of DBP in bile acid biosynthesis through determining the change of  its expression and activity when bile acid biosynthesis increases. METHODS: To activate LXR and increase bile acid synthesis,C57BL/6J mice were fed T0901317 for 7 d and Wistar rats were fed a high-cholesterol diet for 2 wk. Fecal bile acid was measured by auto-biochemical-analysis apparatus. The expression of CYP7A1 and DBP mRNA was analyzed by RT-PCR. DBP protein was estimated by Western Blot. DBP activity was measured by  spectrophotometry. RESULTS: Fecal bile acids  (P<0.05), the mRNA expression of CYP7A1（P<0.05）and DBP (P<0.01),and activity of DBP（P<0.05）in liver of C57BL/6J mice treated with T0901317 and Wistar rats fed high-cholesterol diet were higher than that in the corresponding control groups. The liver protein level of DBP in mice treated with T0901317 also increased  (P<0.05). CONCLUSION: DBP is involved in the bile acid biosynthesis in vivo.

　　【Keywords】 DBP；bile acid sand salts/biosynthesis；LXR； cholesterod 7-alpha-hydroxylase

　　0   引言
   
　　胆固醇由限速酶－胆固醇7α羟化酶（CYP7A1）催化，生成7α-羟胆固醇，进而生成胆汁酸前体三羟或二羟胆甾烷酰辅酶A (THC-CoA或DHC-CoA)后，经过氧化物酶体β－氧化生成胆汁酸. 但β－氧化中加水、再脱氢两步反应由何酶催化？知之甚少. 我们发现,过氧化物酶体内D-3-羟脂酰辅酶A脱水酶／D-3-羟脂酰辅酶脱氢酶，简称D-双功能蛋白（DBP）［1-2］，能在体外催化胆汁酸前体脱水与脱氢［3-4］. 但在体内DBP是否与胆汁酸合成有关有待确定我们用T0901317和高胆固醇分别激活C57BL/6J小鼠和Wistar大鼠肝LXR［5-6］，上调其靶基因CYP7A1的表达，增加胆汁酸的合成后，观察DBP表达和活性改变，进一步确定DBP在体内胆汁酸合成中的作用.

　　1   材料和方法
　　
　　1.1   材料   20只8～10周龄成年雄性C57BL/6J小鼠由北京实验动物中心提供，20只10周龄成年雄性Wistar大鼠由河北医科大学实验动物中心提供；T0901317为Cayman公司产品；（±）-3-羟基癸酰酸、［S］-［-］-α-苯乙胺、辅酶A(HS-CoA)，L-乳酸脱氢酶(LDH)为sigma公司产品；异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、RT试剂盒为Promega公司产品； Taq DNA聚合酶为鼎国化学试剂公司产品. PCR引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成. 其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯.

　　1.2   方法

　　1.2.1   动物分组及取材   将小鼠随机分为对照组和激动剂组，每组10只. 两组均给予普通小鼠饲料. 激动剂组用LXR激动剂T0901317灌胃（20 mg/kg·d），对照组只给予T0901317的溶解剂，连续灌胃7 d. 灌胃第7 日时，将小鼠单笼饲养，收集24 h粪便，用于粪便胆汁酸测定. 灌胃第8 日，小鼠麻醉后，迅速取出肝脏，置液氮中，用于总RNA提取、DBP蛋白量及活性测定.
   
　　将大鼠随机分为两组，每组10只，高胆固醇组，给以高胆固醇饲料（100 g高胆固醇饲料中含有2 g胆固醇，10 g玉米油，88 g标准饲料）喂养；对照组，给以标准饲料喂养. 饲养至第2 周. 尾静脉取血，确认CH组血胆固醇（2.729±0.757 ）mmol/L高于对照组（1.426±0.257 ）mmol/L后，麻醉大鼠，迅速取下肝脏，置液氮中，用于总RNA提取及DBP活性测定. 处死大鼠前1 d单笼饲养收集24 h粪便，用于粪便胆汁酸测定.

　　1.2.2   肝脏DBP活性测定   按［1］的方法制备肝匀浆，按参考文献［7］的方法制备D-（-）-3-羟辛酰辅酶A. 本实验以D-（-）-3-羟辛酰辅酶A为底物用分光光度法测定肝匀浆中DBP的活性［4］. 酶活性单位用kat/kg表示. 蛋白质采用改良Lowry法定量［8］.

　　1.2.3   肝组织CYP7A1和DBP mRNA水平测定   采用异硫氰酸胍一步法提取肝组织总RNA［9］. 以β-actin为内参照，RT-PCR法测定CYP7A1，DBP mRNA的相对表达量. 用凝胶成像分析系统分析经琼脂糖凝胶电泳分离的扩增产物的灰度值. 相对表达量以目的基因与β-actin mRNA的灰度值之比表示. DBP PCR引物： 5′AAGTGATGAAGACTGGGATA3′，5′TGTAGGCAAACAGGAGAA3′，产物793 bp；大鼠CYP7A1引物：5′GCCGTCCAAGAAATCAAGCAGT3′，5′TGTGGGCAGCGAGAACAAAGT3′，产物305 bp；C57BL/6J小鼠CYP7A1引物：5′CTGCTACCGAGTGATGTTTG3′，5′ACTTCTTCAGAGGCTGCTTT3′产物423 bp；β-actin PCR引物：5′GAGACCTTCAACACCCCAGCG3′，5′TCGGGGCATCGGAACCGCTCA3′，产物404 bp.

　　1.2.4   肝组织DBP蛋白水平测定   采用Western blot法测定肝组织DBP蛋白水平. 取C57BL/6J小鼠肝组织制成匀浆，4℃离心后取上清，用改良Lowry法进行蛋白总量测定. SDS-PAGE电泳的蛋白上样量为220 ug. 经过转膜和封闭处理后，对PVDF膜加入DBP一抗（兔抗人），室温静置过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔). 最后用4-氯-1萘酚显色液显色，凝胶成像分析系统照相并分析每个条带的积分光密度值.

　　1.2.5   粪胆汁酸的测定   参照文献［10］的方法，用无水乙醇分别从C57BL/6J小鼠和 Wistar大鼠干燥至恒重的粪便中提取胆汁酸. 用Olympus Au2700型全自动生化分析仪测定胆汁酸，以每克干燥粪便中含有胆汁酸的微摩尔数表示粪中胆汁酸含量（μmol/g）.
   
　　统计学处理 实验数据以 x±s表示，用SAS软件进行统计学处理.两组均数间比较采用t检验，两变量间相关性采用直线相关分析.  以P<0.05为有统计学意义.

　　2   结果

　　2.1   胆汁酸水平   激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠的粪便胆汁酸量(μmol/g)均高于各自的对照组〔（1.323±0.277）vs（1.008±0.205），（5.539±1.710）vs（0.575±0.125）〕.

　　2.2   肝脏CYP7A1, DBP mRNA水平   激动剂组C57BL/6J小鼠（图1A，表1）和高胆固醇组大鼠（图1B，表1）肝CYP7A1，DBP mRNA表达量均高于各自的对照组.   

　　A： 小鼠；B： 大鼠.
 
　　图1   肝CYP7A1和DBP的RT-PCR扩增产物电泳（略）

　　表1   小鼠和大鼠肝CYP7A1 和 DBP mRNA 的表达（略）

　　aP<0.05,bP<0.01 vs对照

　　2.3   肝脏DBP活性的改变   激动剂组C57BL/6J小鼠和高胆固醇组大鼠肝脏的DBP活性（mkat/kg,n=10）均高于各自的对照组(0.25±0.045) vs (0.185±0.04) ，(0.193±0.032) vs (0.147±0.042).

　　2.4   C57BL/6J小鼠肝脏DBP蛋白量的改变   激动剂组C57BL/6J小鼠的DBP蛋白表达量（12±1.0，n=8）高于对照组（10.75±0.866，n=8，P<0.05,图2）.

　　图2   Western blot分析C57BL/6J小鼠肝DBP的蛋白表达量（略）

　　2.5   肝脏DBP与CYP7A1   mRNA水平的相关性  经直线相关分析，C57BL/6J小鼠肝脏DBP mRNA与CYP7A1 mRNA的表达量呈正相关（r=0.6555，P＜0.05）；大鼠DBP mRNA与CYP7A1 mRNA的表达量也呈正相关（r=0.74,P<0.05）.

　　3   讨论
   
　　胆固醇转化为胆汁酸是机体胆固醇排出体外的主要途径. 胆固醇向胆汁酸的转化除了与其合成的限速酶CYP7A1的活性有关外，还涉及胆固醇侧链在过氧化物酶体中的氧化缩短过程. 本实验用LXR人工合成配体T0901317和高胆固醇饮食两条途径激活LXR，增强其下游基因CYP7A1的表达后，微粒体内生成增加的7α-羟胆固醇经羟化、连接辅酶Ａ等反应转变成27碳的胆汁酸前体THC-CoA或DHC-CoA. 后者再经过氧化物酶体β-氧化缩短侧链后转变成胆汁酸，导致粪便胆汁酸生成增多. 与此同时，过氧化物酶体β-氧化途径中催化第二步水化反应和第三步脱氢反应的D-双功能蛋白的mRNA和蛋白表达增强，并与CYP7A1 mRNA表达呈正相关. 表明：LXR激活后，胆汁酸生成增多不仅与胆汁酸合成的限速酶CYP7A1的表达增强有关，还与过氧化物酶体β-氧化途径中的D-双功能蛋白表达增强、活性升高有关. 结合我们以前的实验结果: ①DBP 在体外能将胆汁酸前体24-烯-THC-CoA催化生成24-酮-THC-CoA［3-4］. ②DBP表达及活性升高，可促进胆汁酸合成［10］. ③DBP缺陷患者的血清中有大量的不成熟的27碳胆汁酸堆积［11］，提示DBP在整体水平参与了胆汁酸的合成并发挥重要作用.
   
　　CYP7A1是胆汁酸经典合成途径的限速酶，DBP是过氧化物酶体β-氧化过程中的重要酶蛋白. 激活LXR，上调其下游基因CYP7A1表达的同时，DBP是通过什么机制被上调？DBP与CYP7A1在基因表达的调节机制上是否存在一定的联系？需要进一步证实.
    　　
　　随着人们生活水平的提高，高胆固醇血症的发病率日益上升，已严重威胁了人类的身心健康. DBP在胆汁酸合成过程中发挥重要作用的发现，将为通过胆汁酸的生成降低血胆固醇提供一个新研究靶点.

【】
  　　［1］ Jiang LL,Kobayashi A,Matsuura H,et al. Purification and properties of human D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase: Mdium-chain enoyl-CoA hydratase is D-3-Hydroxyacyl-CoA dehydratase［J］. J Biochem,1996,120(3): 624-632.

　　［2］ Jiang LL,Miyazawa S,Hashimoto T. Purification and properties of rat D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase: D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase/ D-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase bifunctional protein［J］. J Biochem (Tokyo),1996,120(3): 633-641.

　　［3］ Kurosawa T,Sato M,Jiang LL,et al. Stereospecific formation of (24R,25R)-3 alpha,7 alpha,12 alpha,24-tetrahydroxy-5 beta-cholestan-26-oic acid catalyzed with a peroxisomal bifunctional D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase/ D-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase［J］. Biol Pharm Bull,1997,20(3): 295-297.

　　［4］ Jiang LL,Kurosawa T,Sato M. Physiological role of D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase bifunctional protein［J］. J Biochem (Tokyo),1997,121(3): 506-513.

　　［5］ Lehmann JM,Kliewer SA,Moore LB,et al. Activation of the nuclear receptor LXR by oxysterols defines a new hormone response pathway［J］. J Biol Chem,1997,272(6):3137-3140.

　　［6］ Stulnig TM,Steffensen KR,Gao H,et al. Novel Roles of Liver X Receptors Exposed by Gene Expression Profiling in Liver and Adipose Tissue［J］. J Mol Pharmacal,2002,62(6):1299-1305.

　　［7］ Kobayashi A,Jiang LL,Hashimoto T. Two mitochondrial 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenases in bovine liver［J］. J Biochem (Tokyo),1996,119(4):775-782.

　　［8］ Markwell MA,Haas SM,Bieber LL,et al. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples［J］. Anal Biochem,1978,87(1):206-210.

　　［9］ Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction［J］. Anal Biochem,1987,162(1):156～159.

　　［10］ 石如玲，赵朝贤，朱海暴，等. 大鼠肝脏D－双功能蛋白活性增加与胆汁酸合成的关系［J］. 医学院学报，2005,27(3):321-324.

　　［11］ Suzuki Y,Jiang LL,Souri M,et al. D-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase bifunctional protein deficiency:A newly identified peroxisomal disorder［J］. Am J Hum Genet,1997,61(5): 1153-1162.