外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素-γ表达和分泌的关系
作者：陈天艳，陈瑞琳，蔺淑梅，叶峰，张曦，陈云茹，赵英仁，张树林
【摘要】 目的: 研究HBV侵犯外周血单个核细胞（PBMC）及对IFN-γ表达和分泌的影响. 方法: 慢性HBV感染者60例，巢式PCR检测PBMC中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）；ELISA法检测血清IFN-γ水平；实时定量RT-PCR方法检测PBMC中IFN-γmRNA的表达水平. 结果: 48.3%（29/60）的患者PBMC中检测到cccDNA；血清IFN-γ水平低于对照组（P＜0.05）；PBMC中IFN-γmRNA表达水平低于对照组（P＜0.01）；PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于cccDNA阴性组（P＜0.01）. 结论：HBV慢性感染者PBMC中IFN-γ表达和分泌水平降低.
【关键词】 肝炎病毒 乙型 DNA 环状 外周血单个核细胞 干扰素Ⅱ型
【Abstract】AIM: To study how HBV affect the expression and secretion of IFN-γ in PBMC. METHODS: sitty patients with chronic hepatitis B were studied. HBV cccDNA in PBMC were amplified by nest-PCR. The level of IFN-γ in the serum was determined by ELISA. The expression of IFN-γ mRNA in PBMC was determined by real-time RT-PCR. RESULTS: HBV cccDNA in PBMC were determined by 48.3%（29/60）in patients. The serum level of IFN-γ in the patients was lower than that in control group(P＜0.05). The expression of IFN-γ in PBMC wsa lower in the patients than in control group(P＜0.01). The expression and secretion of IFN-γ were lower in cccDNA positive group than in cccDNA negative group（P＜0.01）. CONCLUSION: The expression and secretion of IFN-γ in patients with chronic hepatitis B are decreased.
【Keywords】 hepatitis B virus; DNA,circular; peripheral blood monocytes; interferon typeⅡ
0 引言
HBV感染慢性化是机体免疫功能紊乱，主要是细胞免疫功能低下所致，Th1/Th2细胞亚群的失衡与HBV持续感染密切相关. IFN-γ主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生，可通过多种途径直接或间接促进Th1应答，提高细胞毒性T细胞（CTL），杀伤细胞（NK），单核-巨噬细胞活性，在清除HBV感染的细胞免疫反应中发挥着重要作用. IFN-γ活性水平直接反映了Th1细胞的功能，与HBV感染后的最终结局密切相关. 因此，在证实HBV侵犯PBMC基础上，我们进一步比较慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性和阴性组IFN-γ表达和分泌水平，以了解HBV侵犯PBMC并在其中复制对免疫细胞功能的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 2007-01/2007-05慢性HBV感染者60(男43，女17)例，年龄15～52（平均34.7）岁. 诊断标准符合2000年制定的《病毒性肝炎防治方案》标准. 所有患者均排除HAV，HCV，HDV，HEV，柯萨奇病毒等感染和药物、酒精等其他原因造成的肝脏损害. 健康对照者30例，均来自西安市健康献血员. 无菌采集未抗凝静脉血2 mL,-4℃离心后立即分离血清，-20℃冻存；肝素抗凝静脉血10 mL，常规密度梯度法分离淋巴细胞，洗涤细胞5次，分别收集第5次洗液和细胞. 将细胞分2份，一份-70℃保存，用于检测乙肝病毒核酸；另一份按1×1010/L细胞密度加入1 mL Trizol Reagent，-70℃冻存，用于提取总RNA. Trizol Reagent (美国invitrogen公司),绿豆芽核酸酶（MBN）（美国Promega公司）,High Pure Viral Nucleic Acid 试剂盒（Roche公司）,Rer-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司),Human IFN-γ ELISA Kit(美国Bender公司),扩增引物均由大连Takara 公司设计和合成.
1.2 方法 用High Pure Viral Nucleic Acid 试剂盒提取PBMC中病毒核酸. MBN反应体系：10×缓冲液1 μL；8.33 nkat MBN 1 μL；HBV核酸样品5 μL；纯水补足体积至10 μL. 37℃孵育5 min后立即置于冰水浴中，加1 mol/L Tris-Cl(ph8.0)2 μL终止反应，总体积12 μL. HBVcccDNA引物设计参照［1］，两对引物跨越HBV基因组（rcDNA）单链区和3链区. 外侧上游引物：5′-CCT CTG CCG ATC CAT CTG CGG AAC-3′(nt1255-1279)；外侧下游引物序列为：5′-CTG CGA GGC GAG GGA GTT CTT CTT C-3′(nt2376-2400). 内侧上游引物：5′-CTG AAT CCC GCG GAC GAC CC-3′ (nt1441-1460)，内侧下游引物： 5′-ACC CAA GGC ACA GCT TGG AGG-3′(nt1867-1889). PCR总体积25 μL. 首轮反应条件：预变性95℃180 s,95℃50 s，72℃4min，共35循环,随后72℃延伸10 min；次轮反应条件：预变性95℃180 s,95℃40 s，67℃50 s，72℃60 s，共35循环，随后72℃延伸300 s. 扩增产物长度分别为1149 bp，426 bp. 设阳性、阴性及空白对照.
1.2.1 PBMC中IFN-γmRNA的检测 按Trizol试剂说明书提取总RNA. cDNA合成及实时定量RT-PCR：取上述方法提取的总RNA各2 μg，用Rer-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit分别逆转录20 μ cDNA. IFN-γ上游引物：5′-GCA GCC AAC CTA AGC AAG-3′；下游引物： 5′-TCA CCT GAC ACA TTC AAG TTC-3′. 内对照β-actin 上游引物：5′-GAA CGG TGA AGG TGA CAG CAG-3′）；下游引物： 5′-GTG GAC TTG GGA GAG GAC TGG-3′. 按SYBR Premix EX Taq(perfect real time)试剂盒说明书用荧光染料嵌合法（SYBR Green Ⅰ）同时检测IFN-γ和β-actin表达水平，以IFN-γ/β-actin比值反应IFN-γmRNA表达水平高低. 反应在ABI7300实时荧光PCR仪上进行. 每份样本均设3复孔.
1.2.2 血清IFN-γ水平检测 采用双抗体夹心ELISA法检测,依标准品D（λ）值作标准曲线，再待测样品中细胞因子含量，每份样本均设2复孔. 试剂盒灵敏度0.06 ng/L.
统计学分析：计量资料采用x±s表示，两组间比较采用t 检验. 统计分析用SPSS13.0软件进行. P＜0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 PBMC中cccDNA检出率 慢性HBV感染者60例PBMC中cccDNA阳性（图1）检出率48.3%（29/60），其中HBeAg阳性，HBeAg阴性cccDNA阳性检出率分别为60%(18/30)和36%（11/30）. 慢性HBV感染者淋巴细胞末次洗液及30例对照PBMC中均未检测到HBV cccDNA.
A： 首轮PCR.3：阳性对照，5～6：阴性、空白对照；1～2标本；B： 次轮1： 阳性对照；2，5：阴性、空白对照；4： 标本.
图1 PBMC中cccDNA电泳图（略）
2.2 血清中IFN-γ水平 慢性HBV感染者血清IFN-γ水平低于对照组（t =3.572，P＜0.05）；PBMC中IFN-γ mRNA表达水平低于对照组（t=2.734，P＜0.01，表1）.
表1 慢性HBV感染者PBMCs分泌IFN-γ水平 （略）
aP＜0.05,bP＜0.05 vs 对照.
2.3 PBMC中cccDNA和IFN-γ表达和分泌的关系 慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于阴性组（t=2.256，P＜0.01,表2）.
表2 慢性HBV感染者PBMC中cccDNA和IFN-γ表达和分泌水平（略）
bP＜0.01 vs 阴性.
3 讨论
HBV感染慢性化主要与免疫功能紊乱有关. PBMC对机体的免疫反应起重要作用［2，3］,已成为研究HBV对免疫功能影响的重要途径. cccDNA作为HBV mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染并造成不良结局的关键因素. 检测细胞内是否存在cccDNA可作为判断有无HBVDNA复制的指标. 已有研究证实，HBV慢性感染者PBMC可检测出HBVDNA，多数的研究显示，可在PBMC中发现病毒复制的指标，PBMC已成为HBV在肝外的重要复制场所. 我们发现PBMC中有cccDNA存在，阳性检出率为48.3%，其中HBeAg阳性、HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者检出率分别为60%（18/30）和36%（11/30）与Torii等［4］研究结果一致，表明PBMC可能成为肝细胞以外的HBV寄生和复制的重要场所，是形成肝外感染，导致病情隐匿和慢性化的重要原因之一.
慢性HBV感染者存在免疫功能紊乱［5］，而且PBMC免疫功能紊乱与HBV的复制有明显关系，HBV感染可能影响PBMC产生IFN-γ的能力［6-7］，我们也发现慢性HBV感染者PBMC中IFN-γ表达和分泌水平较对照组下降，与多数研究结果一致. 进一步的cccDNA检测结果显示慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性组IFN-γ表达和分泌水平低于阴性组，更直接表明慢性HBV感染者免疫功能紊乱与HBV直接侵犯免疫细胞有关. 本实验证实，HBV可侵犯PBMC并在其中复制，IFN-γ表达和分泌水平降低，但其分子机制尚不明确.
【】
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