苹果籽油对实验性高脂血症大鼠的防治作用
作者：赵雁武，仇农学，高霞，王多宁，杨颖
【摘要】 目的： 研究苹果籽仁油对高脂血症模型大鼠血脂、主动脉组织形态学及肝组织抗氧化活性的影响. 方法： 50只SD大鼠随机分为5组（n=10），即正常对照组、高脂血症模型组、调和油对照组（2.5 mL/kg）,苹果籽油小剂量组（0.5 mL/kg）,苹果籽油大剂量组（2.5 mL/kg）,正常对照组普通饲料喂养，其余四组均高脂饲料喂养，油组同时给予各种油灌胃，10 wk后断颈取血，全自动生化分析仪测定各组动物血脂，HE染色做病理切片观察大鼠主动脉形态学变化，同时测定肝组织超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）活性及抑制羟自由基（.OH）的能力. 结果： 苹果籽油能使模型大鼠肝组织清除羟自由基（.OH）的能力提高（P<0.01）,SOD的活性增强（P<0.01）. 苹果籽油高剂量组具有降低甘油三脂(TG)提高高密度脂蛋白的趋势，但无统计学意义. 结论： 苹果籽仁油对高脂血症大鼠有降脂趋势，并具有一定的抗氧化作用,这与其主要成分不饱和脂肪酸的作用有关.
【关键词】 苹果籽仁油 高脂血症 自由基 抗氧化剂
【Abstract】 AIM： To investigate the effects of apple seed oil(ASO) on the serum lipids，the aortic tectology and the activity of antioxidation in liver tissues of the hyperlipemia model rats. METHODS: Fifty healthy SD rats were randomly divided into 5 groups(10 rats per group),including control group,hyperlipidemia model group,Mix oil group(2.5 mL/kg BW) and two apple seed oil(ASO) groups:small dosage of ASO group(0.5 mL/kg/kgBW),large dosage of ASO (2.5 mL/kg. BW)group. Control group was fed ordinary forage; model group was fed high-lipid forage,the other groups were garaged by oils besides lipid forage. Blood samples were obtained by cutting necks after ten weeks feeding. After 10-week feeding,the levels of serum lipids were determined; aortic histomorphological changes were observed by the pathological section with the HE staining; the activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase(CAT),and the restraining ability to hydroxyl free radical(OH) in the liver tissues were measured. RESULTS: ASO could restrain OH (P<0.01) and enhance the activities of SOD (P<0.01 or P<0.05). ASO group had tendencies to decrease cholesterol and to increase high-density lipoprotein cholesterol,but there was no significance in statistics(P>0.05). CONCLUSION: ASO had tendencies to decrease blood-lipids. and has the activity of antioxidation.
【Keywords】 apple seed oil(ASO) ; hyperlipidemias; free radical; antioxidants
0 引言
大量实验表明，适量摄入单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）和多不饱和酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）可以降低血清胆固醇和低密度脂蛋白，从而有效的减少心血管疾病发生的危险性［1-2］. 因此，研究开发新型的功能性食品及药品，对防治动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）具有十分重要的意义. 中医认为苹果性味甘、凉，具有生津、润肺、除烦、解暑、开胃等功用. 我国是世界苹果产量最大的国家之一，其中20%用于果汁加. 苹果深加工后弃之的苹果籽得不到合理应用，造成了资源浪费. 本实验室通过冷轧法制备的苹果籽油(Apple seed oil,ASO) 出油率为38%，不饱和脂肪酸含量高达87.04％，其中亚油酸含量占48.56％，油酸含量占38.23％. 同Lu 和于修烛等［3-4］报道的苹果籽油中各种脂肪酸的含量较为一致. 目前苹果籽油对AS的预防作用尚未见报道. 本实验用高脂血症大鼠动物模型，研究了苹果籽油对实验性高脂血症大鼠脂质代谢的影响以及其在体内的抗氧化作用，为苹果籽油的开发和利用提供实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康SD大鼠，清洁级，体质量180～200 g，由第四军医大学实验动物中心提供（实验动物生产许可证号：SCXK（军）2002-006）. 应用高脂饲料(配方［5］：20 g/L胆固醇、3 g/L去氧胆酸钠、75 g/L猪油、50 g/L蛋黄粉、85 g/L基础饲料)喂养SD大鼠建立高脂血症模型. 选用SD大鼠50只，雌雄各半，适应性饲养1 wk后，按性别随机分为 5组：即正常对照组、模型组、调和油组［2.5 mL/（kg·d）］，相当于成人用量的10倍)、苹果籽油小剂量组［0.5 mL/（kg·d）］，苹果籽油大剂量组［2.5 mL/（kg·d）］，每组10只. 对照组普通饲料喂养，其余组高脂饲料喂养，均自由摄食、饮水. 对照组及模型组另给予蒸馏水灌胃，油组并随体质量增长及时调整剂量，实验周期10 wk.
1.1.2 主要试剂 苹果籽油由本室冷轧法制备;调和油(市售). 超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、羟自由基（.OH）测定试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司. 用日立7080型全自动生化分析仪； 721分光光度计，上海第三分析仪器厂；DG3035酶联测定仪，华东管厂；均质机，上海弗鲁克机电设备有限公司;TDL-5低速离心机,上海安亭科学仪器厂.
1.2 方法
1.2.1 取血及血脂测定 实验10 wk后，禁食不禁水12 h，断头取血,3500 r/min离心10 min取血清. 胆固醇 (CHOL) 及甘油三酯 (TG) 测定采用终点法，高密度脂蛋白(HDL-C)测定采用一步法. 试剂盒由北京利德曼生化技术有限公司生产.
1.2.2 取组织及做SOD，CAT及清除.OH活性测定 大鼠断头处死后，立即取肝脏,用生理盐水清洗后,立即置低温冰箱(-40℃)备用. 在测定之前，在冰浴中用生理盐水制成不同浓度的组织均浆，按试剂盒说明做SOD，CAT及清除. .OH活性测定；用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定肝组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量，同时用考马斯亮蓝法［6］测定组织均浆中的蛋白含量.
1.2.3 病理形态学观察 断头处死动物，快速在主动脉弓与胸主动脉交界处取约1cm血管,用生理盐水轻轻冲洗后,置40 g/L多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,制备石蜡切片,HE染色,光镜观察病理改变.
统计学处理： 计量数据用x±s表示，采用 SPSS11.5软件包进行统计处理,多组间比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验.
2 结果
2.1 苹果籽油对大鼠血脂含量的影响 高脂血症模型组大鼠血清CHOL,HDL-C 较正常对照组升高（P<0.05），TG无统计学差异（P﹥0.05）；其它组与模型组比较无统计学差异（P﹥0.05）；苹果籽油高剂量组有降低CHOL 和TG的趋势，调和油与苹果籽油具有升高HDL-C的趋势，但无统计学差异（P﹥0.05）. 另外，由于实验动物性别差异较大，测定的标准差相对较大(表1).
表1 苹果籽油对大鼠血脂含量的影响（略）
a P<0.05 正常对照,b P<0.05 模型.括号中为死亡动物数.
2.2 主动脉壁组织形态学变化 实验大鼠主动脉HE染色光镜病理切片显示，正常对照组动脉内膜光滑，内皮细胞完整，内膜下间隙较小，平滑肌细胞排列整齐，胞浆染色红染；模型组内皮细胞广泛损伤脱落，脂质沉积(图1).
2.3 苹果籽油对实验大鼠SOD,CAT活性的影响 实验大鼠肝组织SOD活性，模型组与正常对照组比较，有下降趋势（P﹥0.05）；调和油及苹果籽油各剂量组与模型组、正常对照组比较均增高（P＜0.05），苹果籽油大剂量组增高更加明显（P<0.01）. 而大鼠肝组织CAT活性，模型组与正常对照组比较，有下降趋势，调和油组、苹果籽油大剂量组与模型组、对照组比较都有增高趋势（P﹥0.05，表2）.
2.4 苹果籽油对大鼠肝组织抑制.OH 的活性作用 实验大鼠肝组织抑制.OH的活性测定结果，模型组与正常对照组比较，其抑制.OH的活性降低(P<0.01）,而调和油及苹果籽油小剂量组与模型组比较，其抑制.OH的能力均增强 (P<0.01)，苹果籽油大剂量组与模型组比较其抑制.OH的能力有增强趋势，但无统计学意义（P﹥0.05，表2）.
A： 正常对照组； B： 模型组； C： 调和油组； D： 苹果籽油组.
图1 实验大鼠主动脉组织病理改变 HE ×40（略）
表2 苹果籽油对高脂大鼠SOD,CAT,MDA及清除自由基作用的影响（略）
a P<0.05 vs,b P<0.01 模型; c P< 0.01 vs正常对照.括号内为死亡动物数.
3 讨论
心脑血管疾病是导致人类死亡的首位原因，而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是众多心脑血管病的主要病理基础. 由于动脉粥样硬化是一个十分复杂的病理过程，其详细的发病机制至今尚未完全明确. 高脂血症是指血浆（血清）中一种或多种脂质的含量超过正常高限的病症，与AS有密切的关系，尤其是胆固醇与甘油三脂皆增高的，患AS的危险性更大. 当血脂升高时，过多脂质沉积于血管内皮，使内皮产生的抗氧化酶活力下降，机体清除自由基的能力下降，产生过多的O2·-,H2O2,·OH等自由基，能直接氧化细胞膜蛋白、膜脂质等，损伤血管内皮；引起一些血循环中的单核细胞浸润到内膜下，并在血管壁上成为巨噬细胞，巨噬细胞释放因子可以刺激平滑肌细胞增生，促进AS的形成［7］. 在生物体内自由基的产生与消除是一个动态平衡的过程，自由基充当了普通反应介质的作用，它受到生物反应中其它生物活性分子的作用和调控［8］，自由基的产生与消除失衡，可能导致疾病的发生，如动脉粥样硬化. 因此，调节血脂、抗氧化、清除自由基是预防和AS的重要途径.
本实验采用高脂饲料喂养的方法，到实验的第10 wk结束测定，模型组血清胆固醇、高密度脂蛋白含量均增高，较正常对照组比较，相差显著（P<0.05），甘油三脂变化不大，且实验动物的性别间差异较大. 从实验大鼠主动脉组织形态学变化看，高血脂症模型组内皮细胞广泛损伤脱落，脂质沉积，见平滑肌细胞胞浆空泡状，胞浆疏松淡染，平滑肌细胞排列紊乱，内膜可见巨噬细胞，说明模型复制成功.
同剂量的调和油与苹果籽油组能显著提高模型大鼠肝组织抑制. OH的能力,增强SOD活性，而对CAT的活性作用影响较小，只有升高趋势，但无统计学意义；从组织形态学变化看，各油组血管平滑肌排列比较整齐，内皮较完整. 这说明苹果籽油富含的不饱和脂肪酸具有降低血脂增强自身抗氧化酶活性趋势，可以有效调节体内自由基代谢，抑制脂质过氧化物的产生，从而发挥抗AS作用.
【】
［1］ Scislowski V,Bauchart D,Gruffat D,et al. Effect of dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids on peroxidizability of lipoproteins in steers［J］. Lipids,2005，40(12):1245-1246.
［2］衡 亮，李 晨，贾 敏,等. 花椒仁油对实验性高脂血症小鼠的治疗作用［J］. 解放军医学杂志，2005,11(30)：1012-1013.
［3］ Constitution of some chemical components of apple seed［J］. Food Chem，1998，61（1）：29－33.
［4］ 于修烛，李志西，杜双奎. 苹果籽油超声波辅助浸提及产品理化特性研究［J］. 农业工程学报，2005，21（9）：155－159.
［5］ 陈志强，丁奇峰，尹智炜，等. 脂可平对实验性早期动脉粥样硬化大鼠主动脉ICAM-1表达的影响［J］. 天然产物研究与开发，2006，18：394-397.
［6］ 王多宁，赵雁武，田芙蓉. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量［J］. 第四军医大学学报,2001，22(6):528-529.
［7］ 孙存普，张建中，段绍瑾. 自由基生物学导论［M］.合肥:技术大学出版社,1999:249-250.
［8］ Jian Mo. A novel theory:biological processes mostly involve two types of mediators,namely general and specific mediators endogenous small radical such as superoxide and nitric oxide may play a role of general mediator in biological processes ［J］. Med Hypotheses，2005，65：728-735.
