瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响
【摘要】 目的 观察瘦素对人L?02脂肪变肝细胞三酰甘油(TG)沉积的影响，探讨瘦素在非乙醇性脂肪性肝病发生、中的作用。方法 人肝L?02细胞培养接种于50 ml 培养瓶中，用50%胎牛血清1640培养基造模，时间24 h。设立正常组、模型组、瘦素处理1，2，3组，处理组瘦素浓度分别为10-7 mol/L，10-6 mol/L，10-5mol/L，分别处理6 h；再以10-6 mol/L 浓度瘦素建立时效关系分别处理（6，12及24 h）。每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱测细胞内TG含量变化。结果 油红“O”染色显示50%的胎牛血清的1640培养基24 h 能成功地制造肝细胞脂肪变性模型，加入瘦素处理后脂肪化程度减轻。高效液相色谱显示细胞内TG明显减少，且与瘦素呈剂量、时间依赖性关系。结论 肝细胞脂肪变性时，瘦素能使肝细胞脂肪化程度减轻，能减少肝细胞TG的沉积,对脂肪肝防治有一定的作用。
【关键词】 脂肪变肝细胞；瘦素；三酰甘油
Effects of Leptin on Disposition of Triglyceride in Fatty Liver Cells
Zhou Hong?yu,Yang Xue?feng
(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital, Nanhua University, Hengyang 421001, China)
Abstract： Objective To explore the effect of leptin on triglyceride's disposition in normal and nonalcoholic induced fatty liver cell. Methods L?02 liver cells were cultured in 50 ml culture dish. Fatty liver cell models were made with 50% inactivated embryo blood serum for 24 hours.Results Oil red staining showed that 50% inactivated embryo blood serum can make fatty liver cell model. After L?02 liver cells were turned into fatty liver cells, leptin was added to fatty liver cells. The HPLC showed that the model group's triglyceride disposition increased clearly, but after leptin was given into the model cells, triglyceride's disposition decreased obviously, which was positive correlated with leptin's concentration. Conclusion When liver L?02 cells were turned into fatty liver cell, leptin can inhibit triglyceride's disposition. Leptin has some therapeutic effect on fatty liver cells.
Key words： fatty liver cell; leptin; triglyceride
非乙醇性脂肪肝（NAFLD）是一种肝组织学改变与乙醇性肝病相类似，但与饮酒无明确关系的临床病理综合征，根据其病改变及临床表现分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化[1,2]。肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所，肝脏选择性地摄取血中的非饱和脂肪酸，经酯化合成三酰甘油（TG），TG在肝细胞内，一方面氧化供能，另一方面分泌入血转化为低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）被其他组织利用。肝脏所含脂质绝大部分为TG，各种致病因素可导致肝细胞内TG异常堆积而导致脂肪肝（FLD）的发生。瘦素是肥胖基因（obese gene）编码的蛋白产物，其受体广泛分布于脂肪、骨骼肌、肝脏、心、肺、胰、卵巢、睾丸等外周组织。瘦素通过与受体结合而发挥作用[3]。瘦素的主要作用是调节机体脂肪的稳定，抑制食欲、增加能耗和减少体质量。本研究以人肝L?02脂肪变细胞模型，通过油红“O”染色、高效液相色谱等方法对瘦素作用后的脂肪变细胞进行研究，了解瘦素与NAFLD的关系，并初步探讨了瘦素对其的作用。
1 材料和方法
1?1 主要试剂和仪器
1640培养基（GIBCO）， 胎牛血清
（成都哈里生物有限公司），胰蛋白酶 （Sigma），1，2，4丁三醇（Buches 瑞士），油红“O” （北京生物化学有限公司），正己烷、异丙醇、乙腈（国产分析物）。二氧化碳恒温培养箱（日本SANYO公司），超净工作台（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜(OLYMPUS)，50 ml 培养瓶，24孔细胞培养板 (NUNC公司)，酶标分析仪（美国Bio?Rad550）。
1?2 实验方法
1?2.1 非乙醇性脂肪变肝细胞模型的建立
人肝L?02细胞株培养接种于50 ml 培养瓶中，在含体积分数10%的灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 链霉素的1640完全培养基中，于37℃，5%二氧化碳培养，饱和湿度，贴壁生长，待细胞长满80%瓶底，消化液消化传代。在更换新鲜培养液后加入胎牛血清，使其浓度为50%，继续培养24 h，即形成非乙醇性肝细胞脂肪变性模型。设正常组、模型组、瘦素处理1，2，3组，瘦素处理组的瘦素浓度分别为10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L，分别处理6 h；再以10-6mol/L 浓度瘦素建立6，12，24 h 的时效关系分别处理。每组均行油红“O”染色观察脂肪化情况，高效液相色谱测细胞内TG含量变化。
1.2.2 油红“O”染色观察造模是否成功
采用Lillie氏油红“Ｏ”染色法：将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养板，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5 min，50%异丙醇固定1 min，油红“O”染色液染色10 min，蒸馏水冲洗3次，每次1 min，苏木素染色5 min，分色和返蓝后，HPIAS?1000 型图像分析系统收集图像。按Wada方法进行脂质染色的半定量分析即根据脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”，细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”，每一块玻片计数100个细胞。
1.2.3 色谱分析和
安捷伦HP1100单元泵，自动进样器，紫外监测器和化学工作站进行分析。检测波长230 nm，流速0.7 ml/min，采用梯度洗脱A：乙腈 B：水0~12 min：75%A~95%A：12 1 min~18 min：75%A。将标准溶液浓度对甘油/内标峰面积比值线性回归后得回归方程用于样品甘油浓度的计算。TG的浓度为总甘油浓度?游离甘油浓度。
1.3 统计学方法
统计分析用SPSS软件，实验数据用均数±标准差（±s）表示 ，两组数据资料比较用t检验及方差分析，P<0．05为有显著性差异。
2 结果
2?1 人肝L?02细胞脂肪化
正常细胞用50%胎牛血清培养基培养24 h 后，用油红“O”染色，显微镜下观察，细胞浆内有大量脂滴存在，符合脂肪化肝细胞特点。同时用高效液相色谱分析细胞内TG明显增加，与正常肝细胞比较有显著性差异（P<0．05），其中细胞内TG从20.19 μg/g 增加到77.51 μg/g，说明细胞内有大量TG聚集，造模成功。
2.2 瘦素对人肝L?02脂肪变细胞TG的影响
人肝L?02细胞用50%的胎牛血清培养24 h 后，分别加入瘦素10-7mol/L，10-6mol/L，10-5mol/L 培养6 h。油红“O”染色，显微镜下观察，细胞内脂滴依次减少。瘦素10-5mol/L 时效关系显示油红“O”染色细胞数明显依次减少。高效液相色谱分析细胞内总甘油与TG模型组比较有显著性差异（P<0．05）。与瘦素呈时间、剂量依赖性关系（见表1，2）。表1 瘦素对人肝L?02细胞细胞内TG影响的量效关系（略）表2 瘦素对人肝L?02细胞细胞内TG影响的时效关系（略）
3 讨论
近年来，随着人们生活水平的提高，饮食结构的变化，检测手段的提高，非乙醇脂肪肝（NAFLD）发病率呈逐年上升趋势。NAFLD根据其病改变及临床表现分为单纯性脂肪肝、非乙醇性脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、脂肪性肝硬化。NAFLD 曾被普遍认为发病率较低，仅发生在伴有非胰岛素依赖性糖尿病的肥胖女性并且愈后良好。但是自1994 年起一系列研究结果表明 NAFLD 的发病在性别间没有明显差异，在非肥胖和糖尿病人中也有较高的发病率，特别是发现NAFLD 可进展至肝炎、肝纤维化和肝硬化之后，才逐渐为人们所重视。肥胖、高脂血症、2型糖尿病与NAFLD 的发病密切相关。大约75%的2型糖尿病患者可发生不同形式的NAFLD；70%的肥胖患者发生脂肪肝，其中18%出现 NASH[4]。NAFLD的发病机制尚非十分清楚，Day 等[5]提出的“二次打击”（two hits）理论目前被广泛认同。多种遗传和代谢性因素的联合作用诱发胰岛素抵抗（IR），后者通过增加的脂肪分解和FFAs转运至肝脏导致第一次打击—脂肪肝形成，并造成肝脏对第二次打击的敏感性增强。氧应激、脂质过氧化等进一步促进 IR，加重氧应激和肝细胞内细胞器损伤，导致炎症反应、肝细胞变性和肝纤维化，即第二次打击。本研究结合［6］采用高脂培养基造模，形成典型的非乙醇性脂肪性肝细胞模型，主要研究NAFLD形成的第一步肝细胞内脂肪沉积及瘦素干预后的变化。第3期瘦素对肝细胞三酰甘油沉积的影响 周红宇，等肝脏是体内参与脂质代谢的重要场所。肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基础，各种致病因素可通过一个或多个环节导致肝细胞内 TG 异常堆积。TG在肝细胞的沉积决定于其合成、代谢及转运三个环节。食物内的脂肪和胆固醇经小肠吸收后，以乳糜微粒与载脂蛋白结合的脂蛋白形式存在于血中，肝脏选择性摄取血中的非饱和脂肪酸，经酯化合成TG，肝细胞不能储存脂肪，TG在肝细胞内，一方面氧化分解供能，另一方面与载脂蛋白B100、C等以及磷脂、胆固醇结合生成极低密度脂蛋白，由肝细胞分泌通过血液循环运输至肝外组织。当肝细胞合成TG增多，转运或氧化障碍时，都可能导致TG在细胞内的堆积，形成脂肪肝。本实验经过高脂培养基培养L?02肝细胞，发现肝细胞普遍发生脂肪变性，细胞肿胀，内含较大的脂肪滴，可将细胞核挤压向胞膜，可见高脂环境可引起肝脏脂肪浸润（TG贮存）。而经过瘦素处理后肝细胞内脂滴明显减少，细胞形态恢复正常，高效液相色谱分析细胞内TG明显减少，与瘦素呈剂量依赖性关系。说明 10-7mol/L~10-5mol/L 浓度的瘦素对离体脂肪变肝细胞有积极的防治作用。瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌合成的由167个氨基酸残基组成的蛋白质类激素。瘦素的表达具有组织特异性，主要在白色脂肪组织中表达，其中皮下脂肪的表达最高，棕色脂肪组织、肌肉、胃黏膜、胎盘滋养层细胞和羊膜细胞也可以合成少量瘦素[7]。瘦素通过靶细胞膜上的受体及相应的信号转导体系发挥作用。OB?Rb共有6种异构体。OB?Rb的胞内结构域最长，由302个氨基酸搭配组成，并包含Janus激酶(JAK)结合结构域以及信号转导转录激活因子（STAT）结合的共同序列YXXQ，OB?Rb是唯一能进行信号转导并调节热量摄入和能量消耗的异形体[8]。OB?Rb主要存在于下丘脑中能表达NPY的细胞表面，与瘦素结合后，通过JAK以及信号转导和转录激活物（STAT）蛋白发挥信号转导作用，调控核内DNA上Leptin效应基因的转录活性。目前JAK?STAT途径被认为是Leptin受体信号转导的主要途径[9]。瘦素可与特异性运输蛋白结合，通过血脑屏障，然后与下丘脑特异受体结合，把体脂信号传递给下丘脑。下丘脑再通过一系列神经体液因素调节机体能量代谢，调整体脂，控制体质量相对恒定。给遗传性肥胖的ob/ob小鼠进行肌内注射瘦素，能够明显抑制食欲，促进代谢，4周后脂肪下降将近75%，而且没有明显的副作用。给ob小鼠脑脊液中注入瘦素后[10]进食量明显减少，体质量渐降正常，而且减少的仅为脂肪组织。且其基础代谢率有所升高，这说明抑制食欲、增加能耗和减少体重可能是瘦素减肥的主要机制。瘦素可能具有从外周直接拮抗肝脂肪变性的作用。 瘦素可以激活AMP活化蛋白激酶(AMP?activated protein kinase)减少脂肪沉积[11]，还可特异性抑制肝脏的硬脂酰基-辅酶A去饱和酶 (stearoyl?CoA desaturase?1)，使肝脏VLDL 生成和脂肪沉积减少[12]。瘦素参与肝脏内糖及脂肪代谢，它通过调控肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的基因表达，促进肝脏对乳酸的摄取，减少TG合成，同时通过蛋白激酶A激活肉碱脂酰转移酶，影响肝脏对TG的氧化代谢[13]。Uygun等[14]认为非脂细胞瘦素受体发生功能障碍时细胞内TG含量能增加100倍，而持续表达的异位高瘦素血症能使细胞内TG耗竭；瘦素还干预胰岛素在肝脏中作用，一方面拮抗胰岛素诱导的PEPCK 下调，抑制胰岛素受体底物?1（IRS?1）的磷酸化，影响胰岛素受体后信号转导；另一方面，瘦素通过对PEPCK 及糖异生的影响，限制TG的合成，提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性，Stumvoil等[15]发现瘦素与脂联素等连用能促进小鼠肝脂肪燃烧及能量消耗，可逆转缺乏过氧化物酶体增殖受体（PPAR）α的脂肪萎缩小鼠的胰岛素抵抗。但是Chitturi等[16]发现NAFLD患者有高瘦素血症，且瘦素水平与肝脏的脂肪变性程度呈直接正相关。最近Chalasani等[17]报道，瘦素水平与脂肪肝的发生并无直接关系。 因此，瘦素对肝脂肪变性的影响尚无定论。本实验经过高脂培养液培养证实细胞内TG明显增加，经过瘦素处理后肝细胞内TG明显减少，与瘦素呈剂量及时间依赖性关系。说明瘦素能明显减少离体脂肪变肝细胞的TG沉积，与文献[ 12,18]报道一致。可见瘦素对非乙醇性脂肪肝具有作用。其对TG的作用明显，体内外实验均表明，其可抑制乙酰COA羧化酶的表达而抑制TG的合成，可激活肉碱脂酰转移酶而促进TG的氧化代谢。本实验通过高效液相色谱分析也显示瘦素处理后脂肪变肝细胞内TG量明显减少，瘦素能使肝细胞内TG沉积减少达到治疗非乙醇性脂肪性肝脏疾病的目的。
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