树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗
【摘要】 树突状细胞（DC）与肿瘤的发生有一定的关系，在这个方面最引人注目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主，进行免疫。随着DC对肿瘤抗原处理、递呈及识别的分子基础以及DC作用机制的进一步阐明，推动了以DC为基础的肿瘤免疫治疗的发展。DC抗肿瘤疫苗具有很好的临床应用前景。
【关键词】 树突状细胞；肿瘤免疫治疗
树突状细胞（Dendritic cells，DC）是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞，它能激活初始型T细胞,激发初始免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。DC与肿瘤的发生发展有一定的关系，不同的肿瘤免疫存在肿瘤相关抗原，若肿瘤患者体内DC功能缺陷,不能有效递呈肿瘤抗原，则导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展[1]。在这个方面最引人注目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主进行免疫治疗。DC疫苗在众多的动物肿瘤模型的治疗中取得了显著的效果，应用此方法对DC进行肿瘤抗原修饰可以解决因DC功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸，而使用何种肿瘤抗原及如何将肿瘤抗原在体外与DC结合，则成了应用DC瘤苗进行免疫治疗的关键。
1 临床用DC的来源及诱导分化方法
DC在体内外分布广泛，普遍存在于除脑组织外的各种组织中，但其数量极少，在血液中仅占单核细胞总数的0.5%~1.0%，在淋巴器官中虽然数量较多，但难以收集，而且由于分离出的DC具有异质性，难以满足对DC的基础研究及临床应用需要。因此，必须进行DC体外培养，诱导分化获取大量的DC以满足对DC临床治疗的需要。目前体外获取人DC的常用方法包括：（1）以外周血直接分离获得DC；（2） 来源于外周血、脐血或骨髓的CD34+细胞体外+GM?GCF和TNF?α的培养条件下获取DC；C?kit配体可提高DC的产量，肝细胞生长因子（HGF）和PMA也是有效的DC分化扩增激活因子[2]；（3） 单核细胞诱导分化扩增。Garderet等[3]了外周血单核细胞体外诱导扩增DC的基本过程，包括用白细胞提取法收集外周血单核细胞，淘选法分离单核细胞，人血清培养液（含患者自体血清或AB血清）或无血清培养液加GM?GSF加IL?4与单核细胞共同培养。另一种方法就是从脐血单核细胞诱导扩增DC，培养条件与外周血单核细胞诱导DC相同。来源于外周血的CD14+单核细胞DC与来源于CD34+细胞的DC在形态、表型、抗原提呈方面基本相似。但前者与后者相比更多的处于成熟阶段，在激活肿瘤特异性的CTL能力上，后者可能更强一些。到目前为止，大多数研究应用单核细胞起源的DC（MoDC），在体外使大量的单核细胞分化为DC，虽然需要外源性细胞因子刺激和较长的培养时间，但是因其具有产量大、纯度高、易获得等优点，能满足实验和临床研究的需要。
2 负载DC常用的方法
2.1 肿瘤特异抗原修饰的DC
由于使用已知的肿瘤抗原多肽，可以避免不必要的免疫刺激。用前列腺特异性膜抗原致敏的DC治疗对激素治疗不再有效的前列腺癌患者，以NPCP标准评估，30%的病人产生了部分免疫应答。血清前列腺特异性抗原和以前可测知的损害下降了50%，并且无副作用产生。
2.2 肿瘤相关抗原（TAA）修饰的DC
这些TAA 包括MAGE?1，MAGE?3，MUCI，Her?2/neu，CEA，Melan/MART等。晚期前列腺癌，恶性黑色素瘤及表达CEA的实体肿瘤患者采用相应抗原刺激DC，均取得了较好的效果。
2.3 肿瘤特异性表位肽修饰的DC
采用特异性表位肽由于其纯度较高，浓度较大， 可以激发较强的免疫反应，且抗原单纯，无诱发自身免疫反应之忧，但不利之处在于其受MHC的限制,绝大多数肿瘤的特异性 抗原表位仍是未知的。因此，这种方法仅见在B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤及黑色素瘤等肿瘤抗原表位肽比较明确的患者中使用。第1期树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗 吴志刚
2.4 全肿瘤抗原修饰的DC
由于只有一部分肿瘤的肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原已知，大部分肿瘤尚未明确，无需明确肿瘤抗原，因而将整个肿瘤细胞作为抗原来源，诸如将DC与肿瘤裂解物或提取物、凋亡或坏死的细胞共培养，或将DC与肿瘤细胞融合。将肿瘤细胞与DC融合，可以获得既具有DC特殊功能又表达肿瘤抗原的杂合体，这种杂合体细胞表达MHC?I，MHC?II抗原，协同刺激分子以及DC特异性或肿瘤细胞表面分子输注以后可以产生抗瘤作用。自体肿瘤细胞与抗原提呈细胞融合制备的杂交细胞，在体内外均可以激发CD4+和CD8+T淋巴细胞介导的免疫反应。此方法应用困难，因为难于获得高纯度并处于增殖状态的肿瘤细胞。
2.5 肿瘤抗原基因转染构建DC
采用转基因手段以某些功能修饰DC，使其在DC中表达，激发特异性抗肿瘤免疫反应。将编码肿瘤抗原的DNA和RNA分子转入DC，可提供较大范围的抗原表位递呈，并且增加了MHC?I和MHC?II分子递呈抗原肽的能力，HLA限制性的抗原选择也可被避免，而且肿瘤抗原编码基因导入DC后能在DC内持续表达肿瘤抗原，可以克服由于DC上抗原?MHC复合物解离或细胞MHC分子降解对其诱导T细胞免疫应答产生的不利影响。用差异筛选等方法获得肿瘤细胞特异性表达的肿瘤mRNA，再用于刺激DC，同时也可将差异筛选获得的肿瘤特异性表达mRNA的导入DC，用于肿瘤的免疫治疗，这样可以避免自身抗原诱发自身免疫性疾病，又可诱导强烈特异抗肿瘤免疫反应，但目前这种技术要求较高，非特异性影响因素较多，操作复杂。
2.6 mRNA瘤苗
因为单一细胞的mRNA成分易于扩增，则肿瘤RNA或相应的CDNA文库为肿瘤抗原提供了无限的来源。Heiser等[4]将前列腺癌细胞mRNA转染DC治疗13例患者，可诱导出明显的T细胞免疫。Ashley等[5]用B16总RNA致敏骨髓来源的DC，介导产生了针对B16肿瘤细胞的特异性CTL，可以保护无瘤动物免受中枢神经系统肿瘤的攻击，延长荷瘤小鼠的生存期。
2.7 病毒瘤苗
目前发现某些肿瘤的发生与病毒感染密切相关，如EB病毒感染与B细胞淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌、外周血T细胞淋巴瘤等多种肿瘤有关。用B细胞淋巴瘤表达的EB病毒核抗原及潜在膜蛋白的表位肽致敏外周血来源的DC，可以激活记忆性T淋巴细胞，产生明显的CTL反应。细胞毒实验证实这些CTL可以杀死B细胞淋巴瘤细胞。用重组腺病毒载体负载的EB病毒抗原基因，如潜在膜蛋白2B(LMP2B)修饰DC基因，48 h 后95%以上的DC展示了有效的基因转染，用转染之后的DC激活CD8+细胞，在第14天针对LMPI肽的T淋巴细胞反应显著增强，21 d 后可以观察到针对自体EB病毒?B淋巴瘤细胞的特异性细胞溶解反应，这一现象为EB病毒疫苗用于EB病毒相关肿瘤的免疫提供支持。
2.8 肿瘤抗原编码基因构建
DC 将IL?12基因修饰的DC细胞直接注入黑色素瘤和肉瘤小鼠模型的肿瘤病灶中，可以诱发抗肿瘤免疫。IL?12基因的转染可以促进DC细胞成熟，表现为MHC?I，MHC?II和共同刺激分子的表达增加。肿瘤抗原编码基因导入DC后可以使其不断释放出肿瘤抗原，从而能更加有效地激活T细胞。
3 DC的临床应用
DC疫苗已经在一系列肿瘤的临床实验中取得了较好的效果，在许多患者体内激发了肿瘤特异性的细胞毒性T细胞反应，并使某些患者体内肿瘤显著消退。瑞典和德国的一个联合小组用抗原多肽或肿瘤细胞溶解产物体外冲击DC，对16例晚期黑色素瘤患者进行治疗，有5例取得治疗效果，其中2例多个器官的转移灶完全消失，另3例部分消退。美国斯坦福大学一个研究小组[6]应用抗特异抗体体外冲击致敏自体DC过继回输，治疗非霍奇金B淋巴瘤患者，结果诱导患者产生了显著的细胞与体液免疫反应，经治4例患者有1例瘤体完全消失，另1例瘤体显著缩小。用人工合成的MAGE?3表位肽负载自身的DC治疗HLA?A24膀胱癌患者，可在体外诱导出高效的、特异性的CTL，经治疗的4例膀胱癌患者3例淋巴结和（或）肝的转移灶明显缩小[7]。Liso等[8]采用独特型抗原肽负载DC治疗26例多发性骨髓瘤患者，结果有24例产生了KLH特异性的细胞增殖反应，4例产生了1 d 特异性的细胞增殖反应，其中3例病灶完全消退。在平均30个月的随访时间内，17例生存。美国西雅图1个研究小组选择PSMA的HLA?A0201特异性抗原多肽体外冲击致敏外周血来源的自体DC，回输治疗51例对激素治疗无效的前列腺癌患者，结果表明该疗法具有一定的临床应用前景[9]。
4 临床治疗
存在的问题及展望由于存在阻碍肿瘤特异性CTL效能的问题，需要采取以下策略：（1）动员、激活肿瘤的免疫T细胞。（2）通过增强Fas配体的表达以及抑制IL?10和血管内皮生长因子的表达。（3）逆转下降的抗原递呈。（4）细胞因子基因修饰增强抗肿瘤作用，如腺病毒介导的IL?2基因修饰DC，使受抗原冲击的DC在体内诱导出更强的抗肿瘤免疫应答。总之，DC瘤苗是抗肿瘤免疫治疗的新方向。根据目前所进行的临床实验，可以说DC瘤苗用于人体是安全的，但治疗方案必须个体化、最优化。疫苗的制备方案、具体注射剂量及途径、与其他佐剂联合应用等问题有待进一步的临床实践和探索。现已进行的治疗大部分集中于晚期患者，随着DC瘤苗的进一步深入研究，由DC介导的抗肿瘤治疗将有很好的前景。
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