胰岛素强化治疗对高血糖烫伤和创伤大鼠肝核转录因子κB的影响

                 作者：张胜兰，张晓雷，寇伟，耿明，刘鹏  

【摘要】  目的 探讨胰岛素强化对高血糖烫伤和创伤大鼠肝脏核转录因子κB（NF-κB）表达的影响。方法 60只Wistar雄性大鼠用链脲佐菌素腹腔注射诱发DM模型，随机分为烫伤强化治疗组（n=15）和烫伤常规治疗组（n=15）,创伤强化治疗组（n=15）和创伤常规治疗组（n=15）。强化治疗组将血糖控制在3.9～5.6mmol/L，常规治疗组将血糖控制在10～12mmol/L。于治疗后第10天活杀取肝右叶部分，4%多聚甲醛固定，切片，免疫组化观察NF-κB的表达。 结果 烫伤和创伤强化治疗组NF-κB表达显著低于烫伤和创伤常规治疗组（P<0.05）。 结论 胰岛素强化治疗组NF-κB表达显著低于常规治疗组，显示胰岛素强化治疗与常规血糖控制相比能更好地抑制炎症反应，发挥机体保护作用。

【关键词】  高血糖大鼠；胰岛素强化治疗；烫伤和创伤；核转录因子κB；肝脏

    【Abstract】  Objective  To  investigate  the effect  of  insulin  intensive  threapy  on  NF-κB  expression  in  the  livers  of hyperglycemic scald and  trauma  rats .  Methods  60  male  Wistar  rats were  received  intraperitoneal  injection  of  streptozotocin  to  establish  diabetic  model.  Then  they  were  randomized  into  4  groups:scald  intensive  therapy  group(n=15) and scald conventional  therapy  group(n=15). trauma  intensive  therapy  group(n=15) and trauma conventional  therapy  group(n=15).  Blood  glucose  was  maitained  at  the  level  of  3.9～5.6mmol/L  in  the  intensive therapy  group ,and  10～12mmol/L  in  the  conventional  therapy  group. At  the 10th  day  after  therapy ,the  livers  were  collected,  then  the  expression  of  NF-κB  was  observed  by  immunohistochmistry.Results  The  expression  of  NF-κB  in scald and trauma  intensive  therapy  group  was  significantly  lower  than  that  in  the  conventional  therapy  group(P<0.05).Conclusion  The  expression  of  NF-κB  in scald and trauma  intensive  therapy  group  was  significantly  lower  than  that  in  the  conventional  therapy  group,  which  suggest  that  insulin  intensive  therapy  can  inhibit  inflammatory  response  better  than  conventional  therapy,  and  exert  protection  to  the  body.

    【Key words】  hyperglycemic  rats;insulin  intensive  therapy; scald and trauma;  nuclear  transcription factor-κB;  liver

    近年的研究已证明，糖尿病患者发生危重症的频率和需要手术干预的机会都比非糖尿病患者要多［1］，而国外在糖尿病危重症的抢救中［1，2］，胰岛素强化治疗较常规治疗可提高其抢救成功率和降低死亡率的优势已见报道。NF-κB是近年来发现的核转录因子，其转录调节的连接点位于许多促炎细胞因子与免疫调节的启动区，对诱导重症疾病的炎症反应起着重要作用。国内罗氏等［3］发现，创伤可明显增强脾细胞NF-κB的DNA结合活性和p65蛋白亚型的表达，在创伤后淋巴细胞活化及全身炎症反应综合征（SIRS）的发生、过程中可能起重要作用。为探讨在糖尿病危重症中胰岛素强化治疗对肝脏NF-κB的影响特做以下实验研究。

    1  材料与方法

    1.1  模型制备   Wistar雄性大鼠60只，购自山东大学实验动物中心，鼠龄8～12周，体重220～240g，清洁级饲养，大鼠禁食12h后按55mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素（购自Sigma公司），3天后测尾静脉血糖>13.9mmol/L为糖尿病成功模型，再把糖尿病大鼠制成烫伤或创伤模型。烫伤模型制备：盐酸氯胺酮（30mg/kg）麻醉，背部90℃下烫伤10s，造成30%总体表面积（TBSA）深Ⅱ度烫伤，伤后即刻腹腔注射5ml生理盐水抗休克，将成模大鼠随机分成A、B两组，A组为烫伤强化治疗组（n=15），B组为烫伤常规治疗组（n=15）。创伤模型制备：清醒状态下双后肢钳断，造成双后肢股骨中部闭合性骨折伴周围软组织挫伤模型，然后将成模大鼠随机C、D两组，C组为创伤强化治疗组（n=15），D组为创伤常规治疗组（n=15）。4组大鼠均每日4次喂食，饮水不限，每日2次腹腔注射庆大霉素注射液0.8万u防治感染。胰岛素强化治疗均采用每日4次皮下注射的方法，即早、中、晚喂食前注射普通胰岛素，21：30注射中效胰岛素。A组与C组使血糖控制在3.9～5.6mmol/L，B组与D组使血糖控制在10～12mmol/L，血糖检测采用美国强生稳豪血糖仪检测尾静脉血糖。4组大鼠均在烫伤或创伤后治疗喂养10天。

    1.2  标本收集和免疫组化方法

    1.2.1  标本的收集  4组均在烫伤或创伤后治疗喂养10天后活杀存活大鼠，取肝右叶部分，放入4%多聚甲醛溶液中固定24～48h。

    1.2.2  免疫组化方法  免疫组化采用链霉卵白素法（SP法），抗NF-κB p65单抗、SP免疫组化试剂盒及二甲基联苯胺（DAB）试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。各组织切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后置于枸橼酸钾缓冲液中微波加热至92～98℃15min以修复抗原，冷却至室温后依次按试剂盒说明完成免疫染色各步骤。

    1.3  免疫组化结果判断［4］  阳性细胞百分比记分：按视野内阳性细胞所占总细胞数的比例记分，0、<25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记分为0、1、2、3、4分。着色强度记分：按阳性细胞着色(颜色)无、弱（淡黄）、中（棕黄）、强（棕褐）分别记分为0、1、2、3分。结果判定：上述两种记分结果相加，0分为阴性（－）；2～3分为弱阳性（+）；4～5分为中等阳性（++）；6～7分为强阳性（+++）。本实验中每张切片随机取3个400倍视野，每个视野均进行阳性细胞百分比记分与着色强度记分，3个视野记分的平均值为该切片的最后得分。

    1.4  统计学分析  等级资料的两样本间比较Mann-Whitney  U检验，借助SPSS11.5软件完成。检验水准α=0.05。

    2  结果

    A组（烫伤强化治疗组免疫组）化染色（图1）：高倍镜视野内可见少量肝细胞胞浆淡黄色颗粒状物质，胞核内亦可见少量淡黄色颗粒状物质。B组（烫伤常规治疗组免疫组）化染色（图2）：高倍镜视野内大多数肝细胞胞浆均可见棕褐色颗粒状物质，胞核内亦可见大量棕褐色颗粒，胞浆和胞核内棕褐色颗粒状物质较烫伤强化治疗组明显增多。

    烫伤强化治疗组NF-κB表达显著低于烫伤常规治疗组（P<0.05，表1）。

    C组（创伤强化治疗组）免疫组化染色（图3）：少量肝细胞胞浆内可见淡黄色颗粒状物质，胞核内亦可见少量淡黄色颗粒状物质。D组（创伤常规治疗组免疫组）化染色（图4）：视野内大多数肝细胞胞浆内均可见棕褐色颗粒状物质，胞核内亦见较多棕褐色颗粒，胞浆和胞核内棕褐色颗粒状物质较创伤强化治疗组明显增多。

    创伤强化治疗组NF-κB表达显著低于创伤常规治疗组（P<0.05，见表1）。 表1  4组间肝脏NF-κB免疫组化染色结果的比较注：强化治疗组与常规治疗组比较，*P<0.05  （Intensive therapy group vs cnventional therapy group,*P<0.05）

    3  讨论

    核转录因子-κB（nuclear  factor-kappa  B, NF-κB）是一种多效炎性核转录因子，广泛参与体内的炎症反应。适度激活具有调节机体防御的作用，而过度激活就会使某些基因过度转录和表达，从而损害机体。

    在大多数细胞中，NF-κB通过与其抑制蛋白IκB直接结合形成无活性的三聚体存留于胞浆中［5］。严重创伤可激活NF-κB的表达［6］。激活的NF-κB（一般为p65/p50）与其抑制蛋白IκB解离，向胞核内易位，从而启动下游基因的转录，如TNF-α、IL-6等，对严重创伤后肝损害起促进作用，而肝内NF-κB的过度激活可能是诱发肝功能衰竭的关键。另外，TNF-α可以通过活化NADPH依赖性氧化酶，促进NF-κB的表达［7］，这可能是NF-κB下游基因过度表达的一种机制。可见NF-κB的活性增强和激活可以增加促炎性介质基因的转录（如TNF-α），但这些介质同样也可以增强NF-κB的活性，当急性炎症发生时，很难确定NF-κB激活是起病原因，还是相关结果，但无论如何，合理的抑制NF-κB的活性均可以产生有效的抗炎作用，而笔者的研究证实胰岛素强化可以有效地抑制NF-κB的活性。

    有研究证明葡萄糖可作为前炎症因素激活NF-κB，促进炎性蛋白的表达［8］。体外实验显示，高血糖能增加主动脉内皮细胞的活性氧物质（ROS）的生成量［9］，而NF-κB对氧化敏感的转录因子，容易被氧化物质激活，并且葡萄糖能促进TNF-α产生，TNF-α又能通过活化NADPH依赖性氧化酶途径，促进NF-κB表达［7］，高血糖的促炎症作用显而易见，这也是为什么强化治疗血糖控制在正常水平大鼠死亡率极低的原因。    研究还发现，胰岛素具有抗炎作用，当然其一是缘于其降糖作用，其二可能是通过抑制NF-κB调节通路，包括诸如TNF-α、巨噬细胞迁移抑制因子等炎性细胞因子的产生和超氧化物产生，来直接发挥其抗炎作用［10.11］。胰岛素输注能降低单核细胞核内NF-κB浓度，升高其抑制蛋白IκB水平，降低活性氧物质（ROS）的产生和p47phox（肥胖患者中尼克酰胺二核苷酸磷酸氧化酶的一个关键蛋白）水平［11.12］，从而发挥其抗炎作用。

    本研究结论：血糖水平与肝脏NF-κB的表达和活化呈正相关。强化治疗组高倍镜视野内仅见少量肝细胞胞浆及胞核内有少量NF-κB表达，而常规治疗组大多数肝细胞胞浆及胞核内均可见大量NF-κB表达。且常规治疗组胞核内有大量NF-κB表达，说明活化的NF-κB较多。提示胰岛素强化治疗把血糖严格控制在4.4～6.1mmol/L比常规治疗能更好地抑制糖尿病危重症的炎症反应，从而对机体产生保护作用。

【】
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2 Van den Berghe G,Wouter P, Bouillon R, et al. Outcome benefit of intensive insulin therapy in the critically ill:insulin dose versus glycemic control. Crit Care Med，2003,31(2):359-366.

3 罗艳，梁华平，胡成香，等.创伤小鼠脾细胞核因子-κB的表达变化. 危重病急救医学，2001，13（7）：393-396.

4 Heidenreich A,Sesterhenn IA,Mostofi FK,et al.Prognostic risk factors that identify patients with clinical stage I nomseminomatous germ cell tumor at low risk and high risk for metastasis.Cancer,1998,83(5):1002-1011.

5 Denham W,Norman J.The potential role of therapeutic cytokine manipulation in acute pancreatitis.Surg Clin North Am,1999,79(4):767-781.

6 Nishiura T,Nishimura T,Deserres S,et al.Gene expression and cytokine and enzyme activayion in the liver after a burn injury.Burn Care Rehabil,2000,21(2):135-141.

7 Fan J,Frey RS,Rahman A,et al.Role of neutrophil NADPH oxidase in the mechanism of tumor necrosis factor-α-induced NF-Κb activation and intercellular adhesion molecule-1 expression in endothelial cells.J Biol Chem,2002,277(5):3404-3411.

8 Pieper GM,Sieben W,Olds CL,et al.Vascular protective actions of a nitric oxide aspirin analog in both in vitro and in vivo models of diabetes mellitus.Free Radic Biol Med,2002,32(11):1143-1156.

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10 Das UN.Is insulin an antiinflammatory molecule?Nutriton，2001,17(5):409-413.

11 Dandona P,Aljada A,Mohanty P,et al.Insulin inhibits intranuclear nuclear factor kappaB and stimulates IkappaB in mononuclear cells in obese subjects:evidence for an anti-inflamatory effect?J Clin Endocrinlo Metab,2001,86(7):3257-3265.

12 Das UN. Insulin and inflammation:furth evidence and discussion.Nutrition，2002,18(6):526-527.