Ⅰ型神经纤维瘤病软骨细胞生物学特性的研究

           作者：陈晖，邱勇，王斌，俞扬，朱泽章，朱锋，钱邦平，马薇薇  

【摘要】  　　目的 检测神经纤维瘤蛋白在Ⅰ型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis，NF1)脊柱侧凸患者软骨细胞中的表达，观察NF1脊柱侧凸患者软骨细胞的生物学特性。方法 先天性脊柱侧凸患者7 例，NF1脊柱侧凸患者6 例，两组年龄和Cobb角接近。脊柱后路手术中取髂骨生长板行软骨细胞分离和培养。取第2代软骨细胞分别检测其增殖活性和Ⅱ型胶原、可聚蛋白多糖等软骨细胞特异性分化指标，并用免疫沉淀和Western blot检测神经纤维瘤蛋白在两组软骨细胞中的表达。结果 NF1脊柱侧凸患者软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达水平明显低于先天性脊柱侧凸组(灰度积分比值分别为1.31±0.53和2.17±1.02，P＝0.03)，其Ⅱ型胶原水平明显低于先天性脊柱侧凸患者组(26.6±11.3 ng/mgpro 和31.7±16.2 ng/mgpro，P＝0.03)，而可聚蛋白多糖水平两组无明显差异(63.0±129.6 ng/mgpro和76.7±519.4 ng/mgpro，P＝0.21)。NF1脊柱侧凸患者软骨细胞显示相对活跃的增殖活性(增殖倍数分别为2.9±0.04和2.49±0.11，P＝0.02)。结论 NF1脊柱侧凸患者软骨细胞神经纤维瘤蛋白表达降低的同时，其细胞增值相对活跃，细胞分化功能也存在缺陷。

【关键词】  神经纤维瘤病 脊柱侧凸 神经纤维瘤蛋白 软骨细胞 生物学特性

　　Biological Features of Chondrocytes Isolated from Patients with Type Ⅰ Neurofibromatosis

　　Abstract：Objective  To detect the neurofibromin expression and observe the biological features of the chondrocytes of patients with type Ⅰneurofibromatosis(NF1) and scoliosis.Methods  7 cases of congenital scoliosis and 6 cases of NF1 scoliosis were chosen with the similar age and Cobb angle.The growth plate was harvested from the ilia，diced and sequentially digested with enzymes.Proliferation of the chondrocytes，and also the specific differentiation indice including type Ⅱ collagen and aggrecan were assayed.Neurofibromin expression in the two kinds of chondrocytes was detected with immunoprecipitation followed by Western blot.Results  Compared to the chondrocytes of patients with congenital scoliosis，lower level of neurofibromin was expressed in chondrocytes of patients with NF1 scoliosis(the OD value was 1.31±0.53 and 2.17±1.02 respectively，P＝0.03).The level of type Ⅱ collagen was lower in chondrocytes of patients with NF1 scoliosis(26.6±11.3 ng/mgpro vs 31.7±16.2 ng/mgpro，P＝0.03)，but the level of aggrecan does not differ between the two groups(63.0±129.6 ng/mgpro和76.7±519.4 ng/mgpro，P＝0.21).The proliferation rate of the NF1 chondrocytes was higher(2.9±0.04 and 2.49±0.11，P＝0.02).Conclusion  With the decrease of neurofibromin expression，the NF1 chondrocytes show higher proliferation rate，and there is also functional deficiency in cell differentiation.
   
　　Key words：neurofibromatosis；scoliosis；neurofibromin；chondrocytes；biological feature

　　脊柱侧凸是Ⅰ型神经纤维瘤病(type 1 neurofibromatosis，NF1)患者的特征性表现之一，发病率高达20％左右［1］，该类型脊柱侧凸由于其骨骼营养不良性改变和术后假关节发生率高等使非常困难。NF1是一种常染色体显性遗传疾病，其典型特征是皮肤咖啡牛奶斑和神经纤维瘤。近年来研究发现，Ⅰ型神经纤维瘤病上述表型可能与神经纤维瘤蛋白功能缺失导致的相关类型细胞功能缺陷有关［2～4］。目前神经纤维瘤蛋白在人软骨细胞中是否表达和NF1患者软骨细胞是否同样存在功能缺陷尚未见报道。本研究在检测NF1软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达的同时，拟对体外NF1软骨细胞的生物学行为进行观察。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料 
 
　　收集两组病例，第1组7 例为先天性脊柱侧凸，均经影像学资料证实有半椎体或椎体分节不良，男2 例，女5 例；年龄7～12 岁，平均8.5 岁。Cobb角为65°～110°，平均84°。第2组6 例为NF1脊柱侧凸，均符合NIH临床诊断标准［5］，男4 例，女2 例；年龄8～14 岁，平均10.6 岁；Cobb角62°～116°，平均87°。第2组6 例患者均为营养不良性脊柱侧凸。所有病例均排除代谢性骨病及激素、抗凝药等药物应用史，骨盆正位片显示双侧髂骨无异常。

　　1.2  软骨细胞培养 

　　本文采用酶消化法进行软骨细胞分离。脊柱后路手术中取髂骨生长板约0.5～1.0 g，在加入少量培养液的无菌培养皿中仔细修整软骨，去除软骨膜和骨组织，将软骨块剪切成直径1 mm左右软骨颗粒。转入无菌的100 mL锥形瓶，0.1M PBS反复冲洗3次，用10倍体积的下列酶溶液依次进行消化，其中0.05％透明质酸酶消化5 min，0.25％胰酶/0.02％EDTA消化30 min，0.2％Ⅱ型胶原酶消化2～3 h，37℃水浴振荡，每次消化后以0.1M PBS洗涤。至软骨颗粒成絮状时停止消化，200目细胞筛过滤，滤液离心1 000 rpm×10 min，培养液洗涤3次。胎盘蓝染色和细胞计数板计数，3×104/cm2密度接种于75 cm2或25 cm2培养皿。每周换液2次，细胞接近融合时0.25％胰酶/0.02％EDTA消化并按1∶3传代。培养液成分：DMEM/F12 1∶1(Hyclone)，10％胎牛血清(FBS，Hyclone同批次血清)，青霉素100 U/mL(Sigma)，链霉素100 μg/mL(Sigma)。细胞培养至第2代进行检测，检测前制备细胞爬片，甲苯胺蓝染色。

　　1.3  细胞增殖活性检测(MTT法) 

　　软骨细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔板，每孔100 μL培养液，每组设6个复孔，分别于第1、3、5、7、9天观察。第3天和第6天换液，检测当日每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，放置CO2孵箱孵育4 h，弃上清后加入100 μL DMSO，混匀仪震荡3 min，酶标仪(Sunrise)570 nm波长检测光密度(optical density，OD)值。根据所测OD值最终增殖倍数(第9天OD值除以第1天 OD值)。

　　1.4  软骨细胞分化指标检测

　　1.4.1  Ⅱ型胶原含量 

　　以每孔4×104个细胞接种于24孔板，每孔0.5 mL，每组3个复孔，10％FBS培养2 d后换2％FBS培养4 d。Ⅱ型胶原主要存在于细胞外基质，检测前需要进行基质消化。每孔加入0.5 mL 0.05 M乙酸(甲酸调至pH2.8～3.0)，细胞铲刮下细胞后转移至1.5 mL Eppendorf管。分别用胃蛋白酶(10 mg/mL溶于0.05 mol/L乙酸，pH2.8～3.0)和胰弹性蛋白酶(1 mg/mL溶于1×TSB，pH7.8～8.0)4°C消化，旋转混匀仪过夜，室温10 000 rpm离心5 min，上清液－70°C保存待用。Ⅱ型胶原检测采用EIA试剂盒(Chondrex)，490 nm波长测量OD值。改良Lowry法蛋白浓度测定，用每孔蛋白浓度进行胶原含量标准化。

　　1.4.2  可聚蛋白多糖水平 

　　以每孔4×104个细胞接种于24孔板，每孔0.5 mL，每组3个复孔，10％FBS培养2 d后换2％FBS培养，第4天取上清－70°C保存待用。检测采用可聚蛋白多糖EIA试剂盒(Biosouce)，450 nm波长测量OD值。改良Lowry法蛋白浓度测定，用每孔蛋白浓度进行胶原含量标准化。

　　1.5  神经纤维瘤蛋白水平 

　　由于直接应用Western blot检测软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达非常困难，本文先用免疫沉淀方法纯化并浓缩该蛋白，然后再以Western blot检测。取3×106个软骨细胞，冷PBS洗涤后加入200 μL RIPA缓冲液(790 mg Tris?HCl和900 mg NaCl溶于75 mL去离子水，PH值7.5，10 mL 10％ NP－40，2.5 mL 10％去氧胆酸钠，1 mL 0.1 mol/L EDTA，76.1 mg 2 mmol/L EGTA，临用前取1 mL RIPA裂解缓冲液加入蛋白酶抑制剂5 μL)，50％(v/v)蛋白A琼脂糖凝胶预处理，改良Lowry法测定蛋白浓度。等量总蛋白中加入2 μg神经纤维瘤蛋白多抗(Novus)，4°C过夜，加入50 μL蛋白A琼脂糖凝胶，4°C过夜，离心、洗涤免疫沉淀产物，十二烷基硫酸钠上样缓冲液溶解沉淀，煮沸后进行7％SDS?PAGE电泳。湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上4°C过夜，5％脱脂奶粉封闭，加入神经纤维瘤蛋白单抗(Zymed，1∶1000)，4°C孵育过夜，二抗常温下孵育3 h，ECL化学发光法检测。胶片用TotalLab 2.0图像分析软件进行分析，所测各条带灰度值和NF1中条带1的灰度值比较得出相对比值。

　　1.6  统计学方法 

　　所有数据用SPSS 10.0处理并进行结果分析，组间差异比较使用独立样本t检验。

　　2  结果

　　2.1  软骨细胞培养 

　　本文中软骨细胞原代培养时间约4～5周，可获得1.5×106～2.0×106个细胞，胎盘蓝染色细胞存活率约85％。细胞按1∶3传代，传代后约14 d细胞接近融合。倒置显微镜下软骨细胞呈椭圆形、锥形或不规则多边形，可见典型的铺路石样改变。细胞爬片甲苯胺蓝染色阳性。

　　2.2  软骨细胞增殖活性 

　　细胞培养第9天NF1脊柱侧凸患者软骨细胞和先天性脊柱侧凸患者软骨细胞增殖倍数分别为2.9±0.04和2.49±0.11(P＝0.02，见图1)。该体外培养的结果显示，与先天性脊柱侧凸患者软骨细胞相比，NF1脊柱侧凸患者软骨细胞增殖更为活跃。

　　2.3  软骨细胞分化特性 

　　软骨细胞分化指标检测结果显示，NF1脊柱侧凸患者软骨细胞体外培养后，其细胞外基质中Ⅱ型胶原含量明显低于先天性脊柱侧凸患者(26.6±11.3 ng/mgpro和31.7±16.2 ng/mgpro，P＝0.03)，NF1脊柱侧凸患者软骨细胞培养上清中可聚蛋白多糖水平和先天性脊柱侧凸患者组无明显差异(63.0±129.6 ng/mgpro和76.7±519.4 ng/mgpro，P＝0.21)(见表1)。表1  先天性脊柱侧凸患者和NF1脊柱侧凸患者软骨细胞分化指标检测（略）

　　2.4  软骨细胞神经纤维瘤蛋白表达水平 

　　免疫沉淀和Western blot检测结果显示两组软骨细胞中均存在神经纤维瘤蛋白表达，其中NF1脊柱侧凸组蛋白表达灰度值平均为1.31±0.53，而先天性脊柱侧凸组蛋白表达灰度值平均为2.17±1.02，P＝0.03(见图2)。该结果提示NF1脊柱侧凸患者软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达水平明显低于先天性脊柱侧凸组。

　　3  讨 论

　　NF1患者骨骼异常的发病率高达50％，其表现以脊柱侧凸和胫骨假关节最为常见，营养不良性改变是NF1患者骨骼异常的主要特征［1，5］。虽然影响NF1患者生存期的主要因素是恶性肿瘤和心血管疾病，但严重的脊柱畸形和经久不愈的先天性胫骨假关节给患者生活带来巨大的影响［6］。迄今为止，脊柱侧凸和胫骨假关节等相关骨骼异常的发病机制仍不清楚，对NF1患者骨骼生物学的了解也相当缺乏。随着对神经纤维瘤蛋白结构和功能了解的深入，目前普遍认为，神经纤维瘤蛋白参与多种组织生长发育及组织修复过程中，细胞增殖和分化的调节，神经纤维瘤蛋白功能缺失，可能是Ⅰ型神经纤维瘤病各种临床表型的基础［7，8］。

　　Kuorilehto等［9］应用免疫组化方法发现小鼠生长板软骨细胞中存在神经纤维瘤蛋白表达，尤其以肥大层明显。本文通过软骨细胞体外培养，采用免疫沉淀和Western blot检测，发现神经纤维瘤蛋白在先天性脊柱侧凸患者软骨细胞中也存在低水平表达。且与先天性脊柱侧凸患者相比，NF1脊柱侧凸患者软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达明显降低，提示NF1软骨细胞中可能存在相应的神经纤维瘤蛋白功能缺失。神经纤维瘤蛋白参与调节诸如神经元分化［10］、心脏发育［11］、血管内膜修复［12］、淋巴细胞发生和功能调控［13］、成纤维细胞介导的伤口愈合［14］等多种重要的生理过程，而且上述功能几乎都是通过三磷酸鸟苷酶活化蛋白相关区域(Ras?GAP related domain)实现的。最近许多研究证实，NF1基因变异后单倍体不足可导致细胞的生物学行为改变，其中包括成纤维细胞、黑色素细胞、肥大细胞、少突胶质细胞、星形细胞等，并认为这些细胞生物学行为的改变可能是NF1患者各种表型的基础［2，3，15，16］。

　　Ras?GAP是Ras信号途径活化的主要抑制环节，而Ras途径也是软骨细胞中重要的信号转导途径［17］，但神经纤维瘤蛋白是否通过Ras?GAP等途径影响软骨细胞功能目前还不清楚。本文对体外软骨细胞生物学特性作了初步观察，检测了Ⅱ型胶原和可聚蛋白多糖等软骨细胞特异性指标，结果显示NF1脊柱侧凸患者软骨细胞所分泌Ⅱ型胶原明显低于先天性脊柱侧凸组，但可聚蛋白多糖水平两组间无明显差异。细胞增殖活性检测显示NF1脊柱侧凸患者软骨细胞增殖活性明显高于先天性脊柱侧凸患者。上述结果提示，NF1脊柱侧凸患者软骨细胞增殖相对活跃，但细胞分化功能存在缺陷。Kolanczyk等［18］最近报道NF1Prx1(NF1＋/－)小鼠生长板软骨细胞增殖率降低，同时细胞分化也存在缺陷，他认为这可能是该小鼠生长迟滞的主要原因。其研究和本文都提示NF1软骨细胞可能存在功能缺陷，但其结果中细胞增殖状态和本文结果相反，该差异是来自种属、基因状态等因素，还是来自实验室误差有待于进一步的研究。

　　Yu等［19］研究发现，NF1＋/－小鼠骨祖细胞表现出较高增殖率和明显的成熟前凋亡，骨祖细胞前体细胞表现较低的成骨细胞分化率。作者也报告了NF1脊柱侧凸患者成骨细胞存在细胞增殖活跃和分化缺陷的研究结果［20］。现有实验结果都提示神经纤维瘤蛋白在骨骼生长发育和重建过程中发挥重要作用。Alwan等［21］推测NF1患者特征性的骨骼改变可能是因为其骨骼系统内在缺陷导致对应力等外在刺激的反应性异常，从而造成异常的骨重建，即NF1患者骨骼异常是内因和外因共同作用的结果。总之，本文发现NF1脊柱侧凸患者软骨细胞中神经纤维瘤蛋白表达降低，其细胞功能存在明显缺陷，软骨细胞功能缺陷可能和成骨细胞一样都是NF1患者各种骨骼异常的共同基础。

【】
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