重组人生长激素对肠缺血再灌注大鼠肠壁IgA浆细胞凋亡及P53基因表达影响的实验研究

        作者：刘海波 孙少川 郑春宁 姜永胜 谭伟

【摘要】目的：探讨肠缺血再灌注损伤时应用重组人生长激素（rhGH）时肠壁IgA浆细胞的凋亡及P53基因的表达的影响。方法：将60只Wistar大鼠雌雄各半随机分为实验组和对照组，按实验天数（2、4、6d）又各分为3组，每组10只，制造肠缺血再灌注模型，实验组给予rhGH［每日1.33U（kg・d）］,观察回肠末端黏膜固有层内IgA浆细胞的凋亡及其P53的表达情况。结果：（1）实验组IgA浆细胞的凋亡在2、4、6天均低于对照组（P＜0.05）；实验组与对照组第6天IgA浆细胞的凋亡均显著高于第2、4天（P＜0.01）；（2）实验组IgA浆细胞中凋亡基因P53的表达在第2天和第6天均低于对照组（P＜0.05）；（3）P53表达与IgA浆细胞的凋亡呈正相关（r=0.812，P＜0.05）。结论：rhGH通过抑制IgA浆细胞的凋亡而调节肠免疫屏障，其机制可能是与抑制凋亡基因P53的表达相关。

    【关键词】促生长素类，重组・肠・再灌注损伤・免疫球蛋白A・浆细胞・基因，P53・大鼠，Wistar

     The effect of rhGH on the apoptosis and  expression of P53 in IgA plasmocytes of intestinal wall after intestinal ischemiareperfusion injury of rats

    【ABSTACT】Objective:To explore the effect of rhGH on apoptosis and the expression of P53 of IgA plasmocytes of intestinal wall after intestinal ischemiareperfusion injury and the correlation between apoptosis and the expression of P53.Methods:60 Wistar rats were divided into two groups randomly:experiment group(1.33U/kg rhGH was given q.d) and control group.Each group was divided into 3 subgroups(2,4,6days,respectively).Apoptosis and the expression of P53 in IgA plasmocytes of ileal mucosal were observed.Results:(1)Apoptosis of IgA plasmocytes in experiment group was lower than that in control group on 2nd,4th,6th day and had statistical significance(P＜0.05);Apoptosis on 6th day was higher than that on 2nd and 4th day in both two groups(P＜0.01).(2)The expression of P53 on 2ndand 6thday in experiment group was lower than that in control group ans had statistical significance(P＜0.05);(3)The experssion of P53 was correlated positively with apoptosis of IgA plasmocytes(r=0.812,P＜0.05).Conclusion:rhGH can inhibit apoptosis of IgA plasmocytes and accommodate the immunologic barrier of intestinal.It come into effect probably by inhibiting the expression of P53.

    【KEY WORDS】Somatotropins,recombinant・Intestines・Reperfusion injury・ImmunoglobulinA・plasma cells・Genes,P53 Rats,Wistar  

　  肠缺血再灌注损伤（ischemiarepefusion injury,IR）是外科中常见的的组织器官损伤之一，不仅可以引起消化道局部的组织损害，而且还可以导致肠内细菌和毒素移位到体循环，引起炎性反应，甚至多器官功能不全、衰竭。凋亡是肠缺血再灌注引起肠道屏障损害的一个重要机制，包括肠壁免疫细胞的凋亡。本实验旨在探讨肠缺血再灌注时应用重组人长生激素与肠壁IgA浆细胞凋亡及其P53表达的相关性。

    1  材料与方法

    1.1  动物模型及分组  取Wistar大鼠60只（购自山东大学医学院动物实验中心），雌雄各半，平均体重（216.2±39.0）g。随机分为缺血再灌注对照组（C）和缺血再灌注实验组（GH）各30只，再按实验天数分为2d(C2,GH2)、4d(C4,GH4)、6d(C6,GH6)组各10只。实验观察期间，Wistar大鼠在温度相对恒定（25.0±1.5）℃，通风的条件下观察，并给与实验用动物饲料喂养，用3%的戊巴比妥钠1m1/kg腹腔麻醉，腹正中切口入腹，找到肠系膜上动脉，分离，用无创伤小银夹夹闭该血管，见肠系膜上动脉血管远端血管搏动明显减弱，用无创伤钳暂时关闭腹腔，计时，观察45min。开腹，取出血管夹，用1号丝线连续关闭腹腔，放回笼内复苏观察。本组实验期间死亡Wistrar大鼠6只，均在术后第1天，均剔除出试验并予以补充，实验组于术后第1天开始皮下肌注重组人生长激素（安苏盟，安徽安科生物工程股份有限公司提供）每天1.33U/kg，用药时间为每天早6～8时。

    1.2  标本的获取  按小时到确切的实验时间 2、4、6d,用10%氯化钾心脏内注射致死动物，开腹取距回盲部2cm近端5～7cm回肠，生理盐水冲洗肠腔后，放入10%甲醛液中固定。

    1.3  标本染色及免疫细胞计数  免疫组织化学染色试剂采用鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人P53多克隆抗体、原位细胞凋亡检测试剂盒（POD法）、HistostainDS双染试剂盒（购自北京中山生物技术有限公司）；DouSPTM免疫组化双染试剂盒（购自福建迈新公司）。按试剂盒指示方法进行IgA浆细胞和凋亡、IgA浆细胞和P53双重染色。免疫细胞的计数：应用01ympus BX50多头显微镜及北京天地公司的病理细胞图像分析系统对切片进行观察和IgA浆细胞凋亡及其P53表达计数。显微镜放大倍数为40×10倍，屏幕图像面积为23.0cm×17.5cm，每个切片找3个富含免疫组织化学双染细胞的视野，计数免疫组织化学双染细胞数目。

    1.4  统计学方法  数据均以x±s表示，应用SPSS10.0进行方差分析和相关性分析，P＜0.05有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  两组IgA浆细胞凋亡观察  IgA浆细胞凋亡双重染色示，凋亡的IgA浆细胞胞浆和胞膜着色呈蓝紫色或绿色，胞核着色呈棕黄色。实验组与对照组相比，第2、4、6天IgA浆细胞的凋亡均减少（P＜0.05），以第6天最明显；实验组与对照组第6天IgA浆细胞的凋亡均显著高于第2、4天（P＜0.01）。见表1 表1  对照组与实验组IgA浆细胞第2、4、6天凋亡数量比较（略）

    2.2  两组IgA浆细胞中P53表达  IgA浆细胞及P53双重染色示，IgA浆细胞着色部位为胞浆和胞膜，呈蓝紫色或绿色，P53着色部位为胞核，呈红色。实验组与对照组相比，第2、6天IgA浆细胞中P53的表达均减少（P＜0.05）。

    2.3  IgA浆细胞内P53的表达与凋亡的相关性  P53表达与IgA浆细胞的凋亡呈正相关（r=0.812,P＜0.05）。表2  对照组与实验组IgA浆细胞第2、4、6天表达量比较（略）

    3  讨  论

    人体能够抵御细菌和内毒素的侵袭而不受伤害，是因为存在肠黏膜上皮、肠道免疫系统、肠道正常菌群、肠道内分泌及蠕动组成的肠道屏障，有效地阻挡着其向肠外组织和器官的移位。其中，肠道免疫屏障在应对创伤、手术、应急及严重感染中的作用越来越被重视。免疫屏障由分泌型免疫球蛋白A（SIgA）和肠道T淋巴细胞组成，其中，SIgA［1］为机体抵抗外来病源微生物的第一道防线，其可以与细菌病毒等结合，阻止吸附在黏膜上，并且可以中和毒素，避免毒素对机体的侵袭。SIgA是由IgA单体通过J链连接而成的二聚体，主要由肠黏膜固有层浆细胞产生，因此IgA浆细胞在肠道屏障中占据重要的地位。肠缺血再灌注是严重创伤、休克后救治过程中可能发生的一个共同的病理生理阶段，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全以及小肠移植的病理演变过程中起重要作用。肠缺血再灌注导致肠道屏障的损害，细菌和毒素移位，从而引起全身炎症和多器官功能不全。在此过程中，伴随着肠道免疫屏障的损害，SIgA分泌减少，使肠道抵御病原体和毒素侵袭能力下降导致肠源性感染；同时，由于SIgA分泌减少，使其对某些抗原物质的封闭作用减弱导致部分T淋巴细胞活化，激活炎性细胞因子，产生过度炎症反应损伤肠黏膜，引起全身炎性综合征［2］。在肠缺血再灌注对肠道免疫屏障的影响过程中，凋亡是一个重要的机制［3，4］。生长激素（GH）是垂体前叶分泌的一种蛋白质激素，其人工制备产品重组人生长激素（rhGH）已广泛应用于临床。rhGH能够调控肠道屏障的免疫能力，保护肠道屏障。GomezdeSegura［5］用rhGH放射性损伤大鼠时发现，应用rhGH7d后，其死亡率和细菌移位明显降低，认为与rhGH增强肠道免疫能力，刺激肠黏膜上皮再生有关。孙少川等［6］在研究rhGH对大鼠肠缺血再灌注肠黏膜免疫屏障中免疫细胞的影响时发现，rhGH可以改善肠道免疫屏障中CD3+、CD4+、CD8+T细胞及IgA浆细胞的数量及比例，增强肠道免疫屏障的功能。在本实验中，应用rhGH后的第2、4、6天，肠壁 IgA浆细胞的凋亡的数量较对照组明显减少，并且以第6天最为显著，这说明rhGH能够抑制IgA浆细胞的凋亡，作用可能在第6天最明显；实验组与对照组第6天IgA浆细胞凋亡的数量均较第2、4天明显增多，表明缺血诱导凋亡，再灌注加剧凋亡，随着再灌注的进行，凋亡亦在增加；实验组第6天IgA浆细胞凋亡的数量较第2、4天亦增多，我们认为rhGH虽然抑制凋亡，但不能完全制止凋亡的进展，同时考虑与rhGH的剂量及应用时间有关。P53基因是肿瘤抑制基因，同时也是凋亡促进基因，参与细胞生长、分化与死亡。在正常小肠组织中P53基因表达几乎缺乏，但损伤后，P53表达型增强的程度几乎与凋亡细胞的分布一致［7］。本实验的结果显示，应用rhGH后的第2、6天，肠壁IgA浆细胞中P53的表达较对照组明显减少，并且以第6天最为显著 ，这说明rhGH能够抑制IgA浆细胞中凋亡基因P53表达。P53表达与IgA浆细胞凋亡呈正相关，据此推测，rhGH可能通过抑制凋亡基因P53的表达来抑制IgA浆细胞的凋亡，但是rhGH如何抑制P53的表达，以及在此过程中是否还有其他凋亡相关基因的相互作用，还有待进一步的研究。

　参  考  文  献

    ［1］李志军，汤日波.肠道屏障功能损害与SIRS/MODS的发生及防治［J］.危重急救医学，2000，12（12）：785.

    ［2］Ikeda S,Zarzaur BL,Johnson CD,et al Total parenteral nutrition supplememtaiton with glutamine improves survival after gutischemia/reperfusion［J］.JPEN,2002,26(3):169.

    ［3］赵佐庆，朱文侠，张志培，等.犬小肠缺血再灌注后NO和SOD的改变及免疫细胞凋亡基因的表达［J］.第四军医大学学报，2003，24（18）：1700.

    ［4］卢辉俊，陈国玉，夏建国，等.血管内放射对颈动脉内膜剥脱术后NO和ET水平的影响［J］.中国普通外科进展，2002，5（4）：217219.

    ［5］Gimez de Segura IA,Prieto I,Grande AG,et al.Growth hormone reduces mortality and vacterial trandication in irradiated rats［J］.Acta Oncol,1998,37(2):179.

    ［6］孙少川，郑春宁，曲飞，等.重组人生长激素对大鼠肠缺血再灌注后肠壁组织T淋巴细胞亚群和浆细胞的影响［J］.中华实验外科杂志，2005，4（22）：447.

    ［7］Potten CS,Merritt A,Hickman J,et al.［J］.Int J Radio Bio,1994,65:71.