血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶

 【摘要】目的：探讨血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达与原发性肝细胞癌（PHCC）侵袭和转移的关系。方法：采用免疫组织化学LSAB法和原位杂交法对40例PHCC和癌旁组织手术切除后的石蜡标本组织中的VEGF和MMP9的表达及微血管密度（MVD）进行了检测。结果：①VEGF、MMP9表达与MVD、PHCC组织中明显高于癌旁组织；②在PHCC中，有转移者及包膜不完整者VEGF、MMP9表达与MVD明显高于无转移者及包膜完整者；③VEGF、MMP9表达与MVD在大肿瘤（直径＞5cm）与小肿瘤（直径≤5cm）两者差异无统计学意义；④VEGF的表达与MVD呈正相关。结论：原发性肝细胞癌组织中的VEGF、MMP9表达与肿瘤的侵袭和转移行为密切相关，可作为判定HCC发生、转移及预后的指标。

    【关键词】肝肿瘤・血管内皮生长因子・明胶酶β・微血管密度・肿瘤转移

      The expression and clinical significance of VEGF and MMP9 in primary hepatocellular carcinoma

    【ABSTRACT】Objective:To study the relationship between the expression of VEGF and MMP9 with invasion,metastasis of primary hepatocellular carcinoma(PHCC).Methods: Paraffinembedded specimens from 40 patients with PHCC undergoing radical resection were studied.Agiogenesis was assessed by the expression of VEGF,MMP9 and MVD using LSAB immunohistochemical staining and in situ hybridization.Results:①The level of VEGF,MMP9 expression and MVD in PHCC was higher than that in the paratumorous tissue(P＜0.01).②The level of VEGF,MMP9 expression and MVD in tumor with tumor metastasis or in nonencapsulated tumors were higher than that in tumors without metastasis or in wellencapsulated tumors(P＜0.05).③There was no significant difference in the level of VEGF,MMP9 expression and MVD between large PHCC(diameter ＞5cm) and small ones (diameter≤5cm)（P＞0.05）.④The expression of VEGF was positively correlated with MVD(P＜0.01).Conclusion:The expression of VEGF,MMP9 and MVD are highly correlated with invasion and metastasis in PHCC,which may serve as a parameter for determining tumor metastasis and prognosis.It may be a new idea to supervise and treat HCC.

    【KEY WORDS】Liver neoplasms・Vascular endothelial growth factor・Gelatinase β・Density・Neoplasm metastasis    原发性肝细胞癌（PHCC）转移率和复发率高，其中以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9,MMP9）为代表的促进微血管生成的因子及蛋白水解酶系统起着重要作用。本文从此角度来研究PHCC，以期对PHCC的发生、、转移及预后能有进一步了解。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  手术切除经病理证实为原发性肝细胞癌的标本40例，男29例，女11例，年龄35~60岁（中位年龄45.6岁）。肿瘤直径＞5cm者占45%（18/40），≤5cm者占55%（22/40）。包膜完整者占37.5%(15/40)，包膜不完整者占62.5%(25/40)。有肝外脏器转移和/或有门静脉癌栓或肝门淋巴结转移者占57.5%(23/40)，无转移者占42.5%(17/40)。对照组为手术中取自肿瘤边缘以外的部位经HE染色病理切片证实无癌变的组织。

    1.2  方法  原位杂交试剂盒（博士德公司），CMIAS真彩色医学图像分析系（北京），兔抗人VEGF多克隆抗体（丹麦Dako公司），兔抗人第8因子相关抗原多克隆抗体（F8RA）（丹麦Dako公司），LSAB试剂盒（丹麦Dako公司）。LSAB免疫组化染色按1进行，原位杂交按试剂盒说明书进行操作。

    1.3  统计方法  VEGF、MMP9表达、MVD与各临床因素之间分析用卡方精确检验法，VEGF、MMP9表达与MVD之间关系用相关分析。

    2  结  果

    2.1  阳性结果判定  VEGF、MMP9：VEGF、MMP9阳性细胞为棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，分布于胞浆。在显微镜100倍视野下随机选择5个阳性细胞最密集区，再在400倍视野下，转换到CMIAS真彩色医学图像分析仪并在屏幕上进行阳性肿瘤细胞计数，当阳性肿瘤细胞≥5%定为阳性，＜5%定为阴性。MVD凡在肿瘤细胞组织中与邻近微血管和肿瘤细胞分界清楚，并被染成棕黄或棕褐色的内皮细胞或内皮细胞簇团，均认为是新生的肿瘤血管。计数方法：在放大100倍视野中，随机选择5个新生血管最密集区，再在400倍视野下进行计数，取其均数，即为新生血管数。

    2.2  检测结果

    2.2.1  VEGF表达  在PHCC组织中总VEGF表达率为70.0%(28/40)，而癌旁组织中为20%（8/40）（P＜0.01），并且癌旁组织阳性表达者中着色较弱、较淡。见图1。PHCC有转移者中VEGF表达率为45.0%(18/23)，无转移者为17.5%(7/17)（P＜0.05）。在包膜不完整者中VEGF表达为76.0%(19/25)，包膜完整者中为40.0%(6/15)(P＜0.05)；直径＞5cm肿瘤者中VEGF表达为55.6%(10/18)，直径≤5cm肿瘤者为50.0%(11/22)(P＞0.05)。见表1。

    2.2.2  VEGF mRNA、MMP9 mRNA表达  PHCC组织中VEGF mRNA表达为0.43±0.04,癌旁组织为0.24±0.06(P＜0.01)。PHCC组织中MMP9mRNA表达为0.41±0.05，癌旁组织中为0.22±0.03(P＜0.01)。VEGFmRNA、MMP mRNA表达与临床病各参数关系见表2。表1  PHCC中VEGF表达、MVD与病理学参数关系

　2.3  MVD  MVD在PHCC中为21.1±8.6，在癌旁组织中为7.8±3.4(P＜0.01)。MVD与临床病理学各参数关系见表1。 表2  PHCC中VEGF mRNA、MMP9mRNA与临床病理学参数关系

    3  讨  论

　恶性肿瘤的生长、侵袭及转移过程受多种因素的影响。近来研究表明，肿瘤新生微血管形成和血管基底膜的蛋白酶在侵袭、转移过程中起着十分重要的作用［2］。VEGF是促进血管生成的惟一特异的生长因子，通过选择性直接作用于血管内皮细胞上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体flt1和KDR/flk1而发挥作用。它既可由一些正常细胞产生和分泌，也可由肿瘤细胞产生［3］。但VEGF在健康成人组织中仅维持正常的血管密度和基本的渗透功能，以利于营养物质的运输，而在许多肿瘤组织中均有较高水平的表达，如在脑肿瘤、结肠癌［4］、胃癌［5］、前列腺癌、甲状腺癌中均与肿瘤生长、转移密切相关。MMPs为基质降解酶，能降解细胞外基质及基质膜，促进癌细胞的局部侵袭性与远处转移。它是一类蛋白结构相近、编码基因与胶原酶基因同源的蛋白分解酶家族，MMP9是其中的一员。它最主要的功能是降解和破坏细胞外基质中最主要的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶［1，6，7］。本研究结果显示，VEGF、MMP9在癌灶组织的阳性表达远高于癌旁组织，说明VEGF、MMP9表达与肿瘤关系极为密切，VEGF、MMP9表达水平有转移组明显高于无转移组，包膜不完整组与包膜完整组差异亦有显著性。提示VEGF、MMP9表达可作为监测肝肿瘤转移的一项指标。第Ⅷ因子（F8）为常用的血管内皮细胞标记物，它是血浆中Ⅷ因子的一种高分子亚基，是一种糖蛋白［8］。本实验中发现，PHCC的MVD明显高于癌旁组织，VEGF与MVD之间呈正相关关系，证实VEGF促血管生成的作用［9］。因此，抗肿瘤血管生成将成为抑制肿瘤生成和转移的新的策略［10］。

　参  考  文  献

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    ［10］CayeThomasen P,Werther K,Nalla A,et al.VEGF and VEGF receptor1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate［J］.Otol Neurotol,2005,26(1):98101.