共刺激分子B7

               作者：纪志鹏 徐克森 刘毅 刘钊

【摘要】目的：探讨共刺激分子B71和B72在大鼠肝脏热缺血伤再灌注损伤模型中的表达情况及其免疫学意义。方法：将雄性Wistar大鼠随机分为3组：A组（缺血30min再灌注24h）、B组（缺血60min再灌注24h）、C组（假手术组）。模型制备Ohmorid的方法。分别取模型之肝左叶，采用实时反转录聚合酶链反应（PTPCR）检测B71和B72在3组肝左叶组织中mRNA表达情况。结果：B71和B72 mRNA在C组以极低水平表达，而在A组、B组表达却明显增多（P＜0.01），且B组高于A组（P＜0.05）。结论：热缺血再灌注之肝脏通过上调B71和B72的表达增加了肝脏的免疫原性。

    【关键词】共刺激分子・再灌注损伤・肝移植・大鼠，Wistar

      Expression of costimulatory molecule B71 and B72 in warm ischemia/reperfusion(I/R) injury of liver in rats

    【ABSTRACT】Objective:To investigate the expression of costimulatory molecule B71 and B72 by warm ischemia/reperfusion(I/R)injury in rat liver and the meaning of immunology.Methods:Male Wistar rats were randomly divided into 3 groups:A(ischemia 30 mins,referfusion 24h),B(ischemia 60 mins,referfusion 24h),C(sham operation group).A model of hepatic warm I/R in rats was established according to the method of Ohmorid.The expression of B71 and B72 mRNA was analyzed by realtime reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR).Results:Compared with the sham operation group,the expression of B71 and B72 mRNA increased significantly in the rats undergoing I/R procedure(P＜0.01).Conclusion:Warm ischemia/reperfusion injury may increase the immunogenicity of the liver by upregulating the costimulatory molecule B71 and B72.

    【KEY WORDS】Costimulatory molecule・Reperfusion(injury)・Liver Transplantation・Rats,Wistar    肝脏缺血再灌注损伤正确处理与否，关系肝脏移植的成败的重要因素之一，而在肝移植手术中，供体肝脏在摘取、灌洗、保存、血流开放等一系列环节中，供体肝脏都会受到缺血再灌注的损伤。共刺激分子B7CD28家族在T细胞激活、形成免疫耐受的重要作用，利用B7CD28家族这一性质，通过免疫反应来防治器官移植排斥反应，在B7CD28家族中，研究最深入的是B71和B72［1］。本实验从免疫学角度对大鼠肝脏热缺血再灌注损伤进行研究，应用RTPCR半定量技术分别检测B71和B72 mRNA的表达情况，探讨热缺血再灌注与急性排斥反应的关系，以期对抑制或减轻肝移植急性排斥反应提出新的预防策略。

    1  材料和方法

    1.1  动物模型与分组  健康雄性Wistar大鼠，体重200~250g，购自山东大学动物试验中心。将动物随机分为3组：A组（缺血30min再灌注24h，n=10），B组（缺血60min再灌注24h，n=10）,C组（假手术组，n=10）.

    动物模型的建立参考Ohmorid［2］的方法（图1）。术前禁食12h，不禁水，乙醚开放吸入麻醉，按照1000U/kg阴茎静脉注射肝素抗凝。腹部正中切口入腹，解剖第1肝门，随后用无损伤血管夹将进入肝左叶和肝中叶的门静脉、肝动脉、胆管以及淋巴管一并夹闭，使缺血范围达70%，A组和B组热缺血时间分别为30min和60min，之后移去无损伤血管夹，恢复肝脏血流，关腹。C组除不阻断肝门血管外，其余操作同A、B组。A组和B组分别于再灌注24h取肝左叶相同部位组织，C组于关腹后24h采集肝左叶组织标本。

     1.2  B71和B72表达水平测定  采用反转录聚合酶链反应（PTPCR）半定量法。采用Trizol（加拿大BBI公司产品）试剂盒，提取组织标本总RNA，以β肌动蛋白（βactin)为内参，βactin、B71和B72的引物序列参照Naosuke Kojima的报道，由山东省医学院协助合成。 βactin上游引物为：5’ATGGARTCCTGTGGCATCCA3’下游引物为：5’CGCTCAGGAGGAGCAATGAT3扩增产物224bp B71 上游引物为：5’GGCATTGCTGTCCTGTGATTAC3’下游引物为：5’ACTCAGTTATGTTGGGGGTAGG3’扩增产物为314bp B72上游引物为：5’GCTCGTAGTATTTTGGCAGGACC3’下游引物为：5’CGGGTATCCTTGCTTAGATGAGC3’扩增产物337bp

    两步法RTPCR反应检测B71、B72 mRNA表达。1%琼脂糖凝胶电泳，Alpha ImagerTM2200凝胶成像系统观察电泳条带存入图像。以系统的SPOT DENSITY软件分别测量内参照和B71、B72基因扩增条带的密度，以B71、B72条带的密度与内参照管家基因的密度比值代表基因表达的相对水平，作扩增产物半定量分析。

    1.3  统计学处理  计量资料以x±s表示，所有数据应用SPSS 13.0软件进行分析。两样本均数比较采用t检验，P＜0.05有统计学差异。

    2  结  果

    B71 mRNA和B72 mRNA在C组几乎不表达，而在A组和B组则明显表达（P＜0.01，P＜0.01）。B71 mRNA.B72 mRNA的表达水平在A组和B组差异均有统计学意义，B组高于A组（图2，表1）。表1  3组B71、B72基因表达水平的比较

    3  讨  论

    缺血再灌注损伤与早期移植肝功能不良（poor early graft function,PEGF）或更为严重的原发性无功能（primary nonfunction,PNF）有密切关系。移植肝的缺血再灌注损伤被视为导致移植肝功能衰竭的四个主要因素之一，缺血再灌注损伤也增加了发生急性排斥反应的几率［3］。研究证实，T细胞介导的免疫反应在同种异体急性排斥反应中起主要作用［4］。T细胞活化与增殖依赖于双信号：一是抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC）呈递的抗原肽MHC复合体，由T细胞受体（T cell receptor,TCR）识别，并将信号传递给T细胞。此信号对T细胞活化是必需的，但不引起T细胞增殖和分泌细胞因子；二是共刺激信号（costimulating signal,第二信号），共刺激信号为T细胞抗原特异性激活所必需，它们启动、维持并调节活化级联反应［5，6］。其中主要的共刺激因子是B7家族成员，B71、B72是最早发现的两个B7家族成员。B71、B72的配体有2种，即CD28和CTLA4（Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4)。CD28与CTLA4在DNA序列上有70%的同源性，均为表达于T细胞表面的跨膜受体，同属免疫球蛋白超家族。CD28分子可持续表达于CD4+、CD8+T细胞表面，而CTLA4只表达于激活的CD4+、CD8+T细胞表面。CD28和CTLA4虽然结构相似，但功能大不一样。CD28和配体B71、B72作用能促进抗原特异T细胞增殖，增强细胞因子分泌，诱导效应T细胞分化，作为T细胞上共刺激分子的受体起着信号传递、增强或放大免疫反应的作用；而活化T细胞上的CTLA4和B71、B72结合，则产生一个负调节信号，抑制T细胞增殖和IL2分泌［7］，CTLA4对T细胞反应具有负调节作用［8］。

    本实验发现，在大鼠肝脏热缺血再灌注模型中，实验组共刺激分子B71 mRNA和B72 mRNA表达较假手术组有明显上调。表明在受体尚未接受供肝时，供肝由于受到缺血再灌注损伤，其内已有B71 mRNA和B72 mRNA表达，提示供肝的免疫原性在经过热缺血再灌注打击后由于B71 mRNA和B72 mRNA的表达上调而增高。B71、B72的增高使T细胞活化具备了必备条件之一，即具备了共刺激信号。当移植肝脏移入受体后，APC呈递抗原肽MHC复合体。从这一时刻，T细胞即被激活，排斥反应随即发生。因此，热缺血再灌注之肝脏由于B71、B72的表达上调而导致更易发生排斥反应。

    CTLA4Ig是由CTLA4与免疫球蛋白重链形成的融合蛋白，它竞争性抑制CD28与B7的结合来阻断信号传递，抑制T细胞活化，达到抑制排斥反应及诱导免疫耐受的作用。Shaked等将携带有CTLA4Ig功能基因的复制缺陷型腺病毒转染ACI大鼠肝脏，并将其移植于Lewis大鼠，发现移植肝脏存活时间明显延长，且无明显副作用发生。Olthoff等用含有小鼠源性CTLA4Ig基因的重组腺病毒灌注冷藏保存的大鼠肝脏，在冷缺血期间体外转染1h，移植肝脏及受者血液中均有CTLA4Ig分子表达，受体长期存活，实验中均将CTLA4Ig运用于供肝切取后或是移植后预防、急性排斥反应。本实验结果提示在供肝经历热缺血阶段之前运用CTLA4Ig来预防急性排斥反应的发生在理论上是可行的。

   　 参  考  文  献

    ［1］纪志鹏.共刺激分子CD28/B7家族在抑制肝脏移植排斥反应中研究现状与展望［J］.普通外科进展，2005，8（5）：260262.

    ［2］M.Ohmori,F.Miyashita,H.Uchida,et al.Effect of erythromycin on ischemia/reperfusion injury of liver in rats［J］.Transpl Proc，2000，32,811881.

    ［3］郑树森.肝脏移植［M］.北京：人民卫生出版社，2001.520.

    ［4］龚非力.医学免疫学［M］.北京：出版社，2003.335.

    ［5］Reiser H,Stadecker MJ.Costimulatory B7 molecules in the pathogenesis of infections and autoimmune disease［J］.N Engl J Med,1996,335(18):13691377.

    ［6］Martin R,McFarland H F,McFarlin D E.Immunological aspects of demyelinating diseases［J］.Annu Rev Immunol,1992,10:153.

    ［7］Krumme MF,Allison JP.CD28 and CTLA4 have oppositiong effects on the response of T cells to stimulation［J］.J Exp Med,1995,182(2):459465.

    ［8］Zheng XG,Turka LA.Blocking Tcell costimulation to prevent transplant rejection［J］.Transpl Proc,1998,30:21462149.