乌斯他丁对大鼠门静脉阻断后肠粘膜屏障影响的实验研究

             作者：徐敬 何建平 郑南 杨福 邬明 沈骅   

　【摘要】目的：探讨阻断大鼠门静脉对肠屏障功能的影响以及乌斯他丁对其损害的保护作用，为临床门静脉阻断后肠屏障功能的保护提供实验依据。方法：SD大鼠70只，随机分为对照组（n=10）、手术组（n=30）、手术+药物组（n=30）。手术组及手术+药物组门静脉阻断时间为40min，门静脉复流4h。70只动物均于手术后4h 40min在无菌条件下取门静脉血2ml检测内毒素：取回盲部肠系膜淋巴结作细菌培养；距回盲部2cm处取小肠肠壁组织1cm，作病检查，观察肠粘膜通透性及其形态学结构改变。结果：对照组与手术组比较，大鼠门静脉阻断后其门静脉血内毒素水平明显上升；肠系膜淋巴结细菌培养阳性率增加；小肠壁形态学结构亦发生明显改变。手术+药物组与手术组比较，上述指标均有改善。结论：大鼠门静脉阻断后可导致其肠屏障功能的损害，乌斯他丁对上述损害具有保护作用。

    【关键词】门静脉阻断・肠粘膜屏障・乌斯他丁・大鼠

     Effects of ulinastatin on intestinal mucosal barrier after occlusion of portal vein in rats

       【ABSTRACT】Objective:To study the effect of portal vein occlusion on intestinal mucosal barrier in rats and the protection of ulinastatin to the injury,to present the experimental data for the clinical surgery.Methods:70 SpragueDawley rats were randomly divided into controlled group (n=10),operation group (n=30)  and operation+medication group (n=30).The portal vein were occlused 40 min in the operation groups and operation+medication groups.2ml blood from portal vein,lymph nodes around appendix,1cm small intestine wall were taken for endotoxin levels,bacterial translocation and pathiology examinations in the all rats 280 mins after operation.The mocusal barrier and microscopic structure of intestine were observed.Results:Compared between the control group and the operation group,endotoxin levels,bacterial translocation rates rise greatly and gut structure change obviously in the latter.Compared between the operation group and operation+medication group,the former changes is also obvious.Conclusion:The occlusion of portal vein can leads the decrease of intestine mocusal barrier and the increase of its permeability.Ulinastatin has a good protective effect on the damages above.

    【KEY WORDS】Occlusion of portal vein・Intestinal mocusal barrier・Ulinastatin・Rats    门静脉血流阻断（portal vein occlusion,PVO）技术是肝胆外科及胰腺外科常用的手术操作方法。然而，门静脉阻断可导致肝脏及肝外器官的损伤［1］，其中肠屏障功能损害是其主要并发症之一。预防和肠屏障功能障碍是基础研究和临床研究的重点。本实验通过建立大鼠门静脉阻断动物模型，术中静脉使用乌斯他丁，观察其对肠屏障功能的保护作用，以期为围手术期临床防治肠屏障功能障碍提供动物实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料  健康成年SD大鼠70只（由昆明医学院动物中心提供），体重（250±50）g，雌雄各半。主要实验仪器：日本 产Olympus显微镜，Mias200型图像分析系统，日本产UA160A紫外分光光度计。主要试剂：鲎试剂、营养琼脂和营养肉汤。

    1.2  方法

    1.2.1  实验动物分组  大鼠随机分为Ⅰ组（对照组，n=10）、Ⅱ组（手术组，PVO40min,n=30）、Ⅲ组（手术+药物组，PVO40min,n=30）。

    1.2.2  手术方法  术前禁食12h，饮水不限，3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔内注射麻醉。寻找鼠尾静脉，在无菌条件下行尾静脉穿刺建立静脉通道。大鼠取上腹部正中切口长约5cm，逐层开腹。Ⅰ组：用盐水纱布将小肠推向下腹部，分离肝胃韧带及肝十二指肠韧带，钝性分离出门静脉，但不阻断门静脉，恢复小肠位置，用盐水纱布覆盖伤口，实验过程中始终保持纱布湿润，手术室温度保持在20~25℃。Ⅱ组、Ⅲ组：手术步骤同Ⅰ组，找到门静脉后均用无创血管夹阻断门静脉，阻断时间为40min，然后松开血管夹进行门静脉复流，4h后取材并处死大鼠。

    用药方法：手术前5min开始经尾静脉连续滴注液体，直至复流结束取完标本后停止。Ⅰ~Ⅱ组：乳酸钠林格液（10滴/min）；Ⅲ组乌斯他丁（5000U/kg，10滴/min,1250U/200ml 乳酸钠林格液）。

    1.2.3  取样  Ⅰ组大鼠于手术后4h40min，Ⅱ~Ⅲ组在门静脉阻断达到40min后，进行门静脉复流4h然后取以下标本，处死动物。（1）门静脉取血，所有与门静脉血接触的物品均预先通过去热源处理，直接穿刺门静脉取血2ml，置于无热源肝素液中，低温保存并在48h内完成内毒素检测；（2）取回盲部周围肠系膜淋巴结，称重0.5g，匀浆，加1ml无菌生理盐水后移入细菌培养基，充分混匀，置CO2孵箱培养48h后观察结果，同时取小肠内粪便作细菌培养。（3）于距回盲部2cm处取小肠壁1cm，用10%福尔马林液固定送检。

    1.2.4  指标检测

    1.2.4.1  门静脉血清内毒素检测  采用鲎试验，偶氮显色法。采用上海医学检验研究所提供的鲎试剂盒（Ⅱ）型，按说明制定标准曲线。按试剂盒内说明进行加样反应操作，加样反应结束后用日本产UA160A紫外分光光度计于545nm波长比色测其吸光度，从标准曲线中查出相应的内毒素含量。

    1.2.4.2  小肠粘膜病理形态学检查  经用10%福尔马林液固定后的小肠组织石蜡包埋切片，HE染色，直接光镜下观察小肠绒毛等变化（见图1~4）。由两位具有10余年临床经验的病理学医师采用双盲法。根据Chiu肠粘膜损伤评分方法［2］对小肠粘膜损伤进行分级并记录。

    1.2.4.3  肠系膜淋巴结细菌培养测定  按上述方法培养肠系膜淋巴结48h后，观察细菌生长情况。标本内出现G-菌，且与肠道粪便培养菌种相同者为阳性。各组标本G-菌阳性率。

    1.3  统计学处理  所得数据采用SPSS10.0统计软件包分析，组间采用方差分析，组内采用t检验，细菌培养阳性结果采用四格表精确概率法，结果以P＜0.05为差异具有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  门静脉血清内毒素水平  Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠门静脉血清的毒素水平分别为0.40±0.18,3.51±0.55,2.70±0.36EU/ml，Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅲ组与Ⅱ组差异有统计学意义（P均＜0.05）。

    2.2  小肠粘膜病理形态学  结果见表1。表1  3组小肠粘膜损伤分级

　　2.3  肠系膜淋巴结细菌培养  Ⅰ组（1/10）和Ⅱ组（21/30）、Ⅲ组（6/30），Ⅱ组和Ⅲ组间细菌培养阳性率差异均有统计学意义（P＜0.01）。

    3  讨  论

    正常肠道粘膜屏障由肠粘膜上皮机械屏障、肠道免疫系统、肠道内正常菌群及肠道内的分泌和蠕动组成。其中最重要的是肠道粘膜上皮机械屏障和肠道粘膜免疫屏障［3］。依靠肠道粘膜正常的机械和免疫屏障，可有效阻止肠道内细菌和内毒素向肠道外移位［3，4］。肠粘膜屏障依赖于肠粘膜的完整性，应激等各种原因可导致肠屏障功能受损，门静脉阻断是其原因之一。

    门静脉血流阻断时，由于胃肠道静脉血液回流受阻，门静脉压力快速上升，动脉血流量下降，肠道处于缺血、缺氧状态，导致肠粘膜发生一系列病理生理改变［4］：（1）缺血导致肠粘膜营养物质来源中断，造成底物不足。缺氧代谢可致合成细胞器的各种物质及细胞代谢所需能量缺乏，致肠组织细胞受损。（2）导致肠粘膜内大量氧自由基产生。（3）缺氧可引起肠粘膜细胞内钙离子超载，钙超载是细胞死亡的最终途径。（4）激活肠道局部抗原递呈细胞释放大量炎性介质，如血小板活化因子（PAF）、肿瘤坏死因子（TNF）、IL2、IL6等细胞因子。（5）门静脉复流后导致肠粘膜发生缺血再灌注损伤。通过上述多种途径，门静脉阻断导致肠粘膜形态及功能的损害。

    肠道是人体内最大的“细菌和内毒素库”，肠粘膜屏障功能受损后可导致肠道细菌和内毒素移位，成为最重要的内源性感染源［3］。与此同时，大量细胞因子和炎症介质在应激和感染双重打击因素的诱导下超量释放，大大启动和加速失控性全身炎症反应（SIRS）和脓毒症的发生，导致MODS［6］。

    本研究观察到，与对照组比较，在光镜下门静脉阻断组大鼠肠粘膜表现为间质充血、水肿，绒毛顶端下间隙增宽、绒毛脱落、坏死；以门静脉血清内毒素水平及肠系膜淋巴结肠道细菌移位率测定肠粘膜通透性改变也同样显示门静脉阻断后血清内毒素水平及肠系膜淋巴结肠道细菌移位率均升高。本实验从形态学及功能两方面证明了门静脉阻断可导致肠粘膜屏障功能受损。

    乌司他丁是从男性尿液中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂，为糖蛋白，由143个氨基酸组成，是一种广泛存在于界的典型的Kunitz型的蛋白酶抑制剂。乌斯他丁及其分子产物对酶有高效抑制作用，能同时独立抑制多种酶的活性［7］。

    本研究结果显示，乌斯他丁可以改善门静脉阻断所致肠粘膜损伤，表现为肠粘膜绒毛坏死脱落程度减轻，血清内毒素水平及肠系膜淋巴结细菌移位率下降。门静脉阻断导致大鼠肠粘膜缺血缺氧以及门静脉复流后产生的缺血再灌注损伤，产生大量的炎症介质以及肠道细菌和内毒素移位，造成肠道及肠外组织和器官的损伤。乌斯他丁是一种广谱的非特异性蛋白酶抑制剂，能抑制和对抗各种原因引起的多种蛋白酶、炎症介质和氧自由基的释放和作用（多形核粒细胞弹性蛋白酶（PMNE）、细胞膜溶酶体酶、TNFα、IL6、IL8、ICAM1）［8］，从而阻断或减轻SIRS反应、维持了SIRS和SARS的平衡，减轻全身损害，避免MODS的发生，局部表现为肠粘膜屏障功能的改善。本实验没有检测手术组和手术加药物组血清炎症介质及氧自由基等因子的浓度变化，有关此方面的研究有待进一步进行。

    临床上PVO技术是肝胆外科及胰腺外科常用的手术操作方法，常用于肝移植、肝叶切除、血管置换扩大的胰十二指肠切除术、胆管癌根治术等手术。门静脉阻断加之手术的创伤、麻醉的打击以及病人的原发疾病均可导致肠粘膜屏障功能受损，从而引起肠粘膜通透性增加、肠道细菌及内毒素移位。大量肠道内细菌和内毒素经门静脉和淋巴系统侵入人体循环，造成肠源性感染和内毒素血症，并经一定条件激发细胞因子和其他炎症介质的连锁反应，引起全身各器官的损害。这在多器官功能不全综合症（MODS）的发生和中起着十分重要的作用。实际上很多情况下，肠粘膜屏障功能衰竭的发生要早于其他脏器。Meakins［9］等将肠道称之为创伤后多器官功能衰竭的起源，Wilmore［10］将肠道称之为“外科应急条件下的中心器官”。目前的临床外科工作中对门静脉阻断后肝脏损害的研究较多，而对肠粘膜屏障的损害却往往被忽视。近20年来，尽管心肺复苏、高效广谱抗生素、脏器支持技术有了很大发展，但MODS的重症病人的生存率未见明显改善和提高［11］。肠粘膜屏障功能障碍应引起临床上足够的重视。重大手术、实施门静脉阻断操作时术中，术后使用乌斯他丁，对预防和肠屏障功能障碍，降低手术后并发症的发生率和死亡率具有重要意义。

　　参  考  文  献

    ［1］吕新生，李建元，韩明，等.常温下长时间阻断肝门对全身血流动力学、生化及肝脏影响的实验报告［J］.实验外科杂志，1990，7（1）：16.

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    ［3］吴国豪.肠屏障功能［J］.肠外与肠内营养，2004，11（1）：4447.

    ［4］王红禄.重症急性胰腺炎肠粘膜屏障功能的损伤及预防［J］.中国普通外科进展，2004，7（6）：321.

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    ［6］梁存河，蒋朱明.胃肠屏障研究的几个问题［J］.中国危重病急救医学，2001，13（4）：202204.

    ［7］段永红，郭炳麟，商中华.乌斯他丁临床应用［J］.临床医药实践杂志，2004，13（2）：8687

    ［8］张泓.乌斯他丁对感染性休克患者TNF、MDA、NO及β葡萄糖醛酸酶的影响［J］.中华实验外科杂志，2001，18（增刊）：156157.

    ［9］Meakins JL,Marshall JC.The gastrointestinal tract::the motor of MOF［J］.Arch Surg,1986,121(2):197201.

    ［10］Wilmore DW Smith RJ,O’Owyer.The gut:a central organ after surgical stress［J］.Surgery,1988,918:917.

    ［11］Renner I,Savage WT,Pantoja JL.Death due to acute pancreatitis:a restropective analysis of 405 autopsy cases［J］.Dig Dis Sci,1985,30:10051010.