氧化苦参碱抑制人肝癌细胞EGF和EGFR表达的研究

            作者：王文奇 刘倩 徐瀚峰 时昌文 吴洪文

  【摘要】目的：探讨氧化苦参碱对人肝癌细胞EGF及EGFR表达的影响。方法：将肝癌细胞株BEL7402在37℃、5%CO2条件下培养、传代。按氧化苦参碱浓度分为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml 3组，对照组不加氧化苦参碱，每组设6个平行孔，每孔加入细胞1×105/ml，培养24h、48h和72h，分别进行EGF及EGFR的免疫组化染色。结果：不同浓度的氧化苦参碱均抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达，随着培养时间的延长，EGF和EGFR表达阳性率下降显著，在1000μg/ml组24h、48h和72h的EGF和EGFR阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率下降显著（P0.05,P0.01）。500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异。结论：氧化苦参碱对EGF和EGFR的抑制途径可能是其抗肝癌机制之一。

    【关键词】氧化苦参碱・表皮生长因子・受体，表皮生长因子・癌，肝细胞

      Inhibiting effect of oxymatrine on the expression of EGF and EGFR in human hepatocellular carcinoma cells in vitro

      【ABSTRACT】Objective:To investigate the effect of oxymatrine on EGF and EGFR expression in human hepatocellular carcinoma cells,BEL7402.Methods:BEL7402 cells were cultured under the condition of 37℃,5%CO2.BEL7402 cells were treated by oxymatrine with different concentration,including 1000μg/ml,500μg/ml,250μg/ml,and 0μg/ml,and the observation period was from 24h to 72h.Four groups were divided.Each group contains six wells.There are 1×105/ml cells in each well.The expression of EGF and EGFR were observed with immunohistological technique.Results:The expression of EGF and EGFR were suppressed by oxymatrine with different concentration and variable durations.In Group A(1000μg/ml),the expression of EGF and EGFR at 24h,48h and 72h decreased more significantly than Group B(500μg/ml),and Group C(250μg/ml) (P0.05,P0.01).There were no significant difference between EGF and EGFR expression at the different treating durations in Group B and Group C.Conclusion:Oxymatrine can play a certain role in treatment of liver cancer through inhibiting the expression of EGF and EGFR.

    【KEY WORDS】Oxymatrine・Epidermal growth facter・Receptor,epidermal growth facter・Carcinoma,hepatocellular    表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）对肝癌的发病有一定的促进作用。近年研究表明，氧化苦参碱具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞调亡［1］、抗纤维化等作用［2］，今观察其对人肝癌细胞EGF及EGFR表达的影响，报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料  人肝癌细胞系BEL7402 由山东省医科院免疫室提供。氧化苦参碱粉由正大天晴有限公司提供（批号20040920），用生理盐水配成需要浓度。RPMI1640细胞培养液为美国Gibco公司产品。即用型鼠抗人EGFR单克隆抗体与鼠、兔通用型SP试剂盒和联苯二氨（DAB）显色试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司，浓缩型兔抗人EGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程公司，用抗原稀释液1∶30稀释后使用；小牛血清为天津TBD公司产品。

    1.2  细胞培养  将肝癌细胞株BEL7402 培养于含10%小牛血清的PRIM1640培养液中，内加青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml，37℃、5%CO2条件下在75细胞培养瓶中培养、传代，分装于多个培养瓶，采用处于对数生长期的细胞进行实验。

    1.3  分组  按照氧化苦参碱的浓度不同分为3组，即1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml，对照组不加氧化苦参碱，每组设6个平行孔，每孔加入细胞1×105/ml，加入不同浓度氧化苦参碱后培养24h、48h和72h，分别进行EGF及EGFR的免疫组化染色。

    1.4  EGF及EGFR的免疫组化  收集3种浓度氧化苦参碱处理过的细胞，配成1×106/ml悬液，取两滴细胞悬液于紫外线照射2h后的载玻片上，放入湿盒，置于37℃、5%CO2培养箱中，细胞爬片生长4h后，置于4℃1∶1甲醇；丙酮中20min固定。PBS清洗，每张载玻片加50μl非免疫性动物血清封闭，37℃孵育30min，分别在每张载玻片加入50μl EGF、EGFR，4℃过夜，加入50μl生物素标记的二抗，37℃孵育1h后，加入50μl亲和素过氧化物酶溶液，37℃孵育40min，加100μl新鲜配制的DAB显色，苏木素复染，1%盐酸酒精分色，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。

    1.5  镜下观察  EGF阳性细胞为胞浆染成棕黄色颗粒，EGFR阳性细胞为胞膜染成棕黄色。200倍视野计数200个细胞，5个视野的平均阳性细胞率，然后计算每组中EGF、EGFR平均阳性细胞率。

    1.6  统计学方法  所得数据均用x±s表示，采用SPSS12.0统计学软件进行分析，方差分析以P0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  氧化苦参碱对EGF表达的影响  见表1。不同浓度的氧化苦参碱均抑制EGF在人肝癌细胞的表达，随着培养时间的延长，EGF阳性率下降显著。1000μg/ml组24h、48h和72h的EGF阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率下降显著（P0.05,P0.01），500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异。72h和48h EGF阳性表达率较24h阳性率明显下降（P0.05，P0.01)，72h与48h阳性表达率差异无统计学意义。

    2.2  氧化苦参碱对EGFR表达率的影响  见表2。不同浓度氧化苦参碱均可抑制EGFR在人肝癌细胞的表达，且随着培养时间的延长，EGFR阳性率下降显著。1000μg/ml组各时段的EGFR阳性率均较500μg/ml组和250μg/ml组阳性率下降显著（P0.05,P0.01），500μg/ml组和250μg/ml组同时段的阳性率无明显差异；72h较24h EGFR阳性表达率下降显著（P0.05）,24h和48h、48h和72h的阳性表达率无明显差异。

    3  讨  论

    EGF和EGFR在正常细胞分裂增殖和恶性转化中具有重要作用［3］。实验表明，EGFR在大鼠肝癌形成过程中第4周即有表达，吴晓英等发现人肝癌组织中EGF和EGFR的阳性率显著高于癌旁和癌远部［4］，而且EGFRmRNA阳性率在肝癌组织中显著高于癌旁组织中，EGFRmRNA在肝癌组织中阳性率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发等明显相关［5］，EGF可通过增加S期肝癌细胞数量来上调EGFR［6］。

    近年研究发现，氧化苦参碱除具有良好的抗HBV和HCV的作用外［7］，尚有改善肝细胞功能，抗肝纤维化，调节免疫功能，清除自由基，抗肿瘤等作用，其抗肿瘤作用已逐渐引起重视。氧化苦参碱可抑制细胞进入S期，从而使细胞在  表1  3种浓度氧化苦参碱对EGF表达率的影响 24h组G1期堆积，又可促进G2期细胞进入M期；对人肝癌细胞系SMMC7721研究发现，氧化苦参碱作用后可增加G0/G1期细胞所占比例，阻止细胞进入S期，最终使肿瘤的增殖速度受到抑制［8］。

    本研究采用不同浓度的氧化苦参碱作用于人肝癌细胞，观察EGF和EGFR阳性细胞率的变化，发现3种浓度的氧化苦参碱均可抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达，1000μg/ml组作用最强；随着培养时间的延长，EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达率下降明显，72h抑制作用最强，在1000μg/ml组阳性率下降尤为明显，提示氧化苦参碱抑制EGF和EGFR在人肝癌细胞的表达呈明显浓度及时间依赖性，与报告一致［8］。本研究结果表明，氧化苦参碱抑制EGF和EGFR表达需要较高浓度，而且需要一定时间才能发挥更大作用。氧化苦参碱可能直接抑制EGF对肝癌细胞的增殖作用，使其不能对EGFR发挥上调作用；氧化苦参碱本身也抑制肝癌细胞进入S期，二者共同作用最终抑制肝癌细胞增殖。但氧化苦参碱对EGF和EGFR的抑制途径及机制尚未完全明确。

    参  考  文  献

    ［1］胡聪，韩聚强，修贺明.氧化苦参碱及苦参碱对大鼠肝细胞凋亡的影响［J］.中华传染病杂志，2003,21（1）5052.

    ［2］Shi GF,Li Q.Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechanism in vivo［J］.World J Gastroenterol,2005,11(2):268271.

    ［3］王文奇，徐瀚峰.表皮生长因子及其受体与肝癌的关系［J］.国外医学肿瘤学分册,2005,32(3):212214.

    ［4］吴晓英,彭隆祥.表皮生长因子及其受体在人原发性肝细胞癌中的表达［J］.湖南医科大学学报，1997,22(6):544546.

    ［5］赵荫农,曹骥,吴飞翔，等.EGFmRNA和EGFRmRNA在肝细胞癌组织中的表达及其意义［J］.癌症,2004,23(7):762766.

    ［6］金志明,王天翔,陈心江,等.表皮生长因子对人肝细胞癌EGFR/DNA表达的影响［J］.上海第二医科大学学报2002,22(6):489491.

    ［7］Wu XN,Wang GJ.Experimental studies of oxymatrine and its mechanisms of action in hepatitis B and C viral infections［J］.Chin J Dig Dis,2004,5(1):1216.

    ［8］钱学敏,李继强,罗鸿予,等.氧化苦参碱抑制SMMC7721细胞增殖的研究［J］.上海第二医科大学学报,2002,22(6):512514.