Bcl-2基因在阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡中的作用
【摘要】 目的：探讨Bcl-2基因对阻塞性黄疸大鼠肝细胞损害中细胞凋亡的调控作用。方法：采用胶原酶原位肝灌注法获取对照组大鼠肝细胞及阻塞性黄疸实验组术后3、7、14、21 d大鼠的肝细胞，分别用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA的表达。分离对照组及实验组14 d组大鼠的肝细胞行原代培养后,使用100 μmol/L甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）作用于两组肝细胞24 h后，用FCM法测定肝细胞的凋亡比率，用TUNEL技术进行肝细胞凋亡的原位检测。结果：（1）对照组大鼠肝细胞无Bcl-2 mRNA表达，实验组术后7、14、21 d组大鼠肝细胞均有Bcl-2 mRNA表达；（2）GCDC作用两组大鼠肝细胞后,实验组比对照组肝细胞凋亡明显减少（P< 0.001）。结论：在阻塞性黄疸过程中，大鼠肝细胞通过表达Bcl-2基因是抑制胆盐致肝细胞的凋亡作用的途径之一。
【关键词】 凋亡 黄疸 阻塞性 基因 Bcl-2 大鼠 Wistar
Role of Bcl-2 gene in apoptosis of hepatocytes in rats with obstructive jaundice
【ABSTRACT】 Objective: To explore the regulating mechanism of Bcl-2 gene in hepatocyte injury caused by obstructive jaundice in rats by comparing apoptotic rate. Methods: Normal rats’ and bile duct-ligated 7 d, 14 d, 21 d rats’ hepatocytes were isolated by in situ collagenase perfusion and primary culture. （1）Bcl-2 mRNA was detected by RT-PCR in all cells; （2）After normal rat and bile duct-ligated 14d rat hepatocytes were added 100 μmol/L GCDC and kept for 24 hours, cells were evaluated by FCM and TUNEL. Results:（1）Normal rat hepatocytes did not express Bcl-2 by RT-PCR technique. Bcl-2 was expressed in 7-,14-,21- day BDL rats.（2）After adding 100 μmol/L GCDC and keeping for 24 hours, the apoptosis of bile duct-ligated rat hepatocytes significantly decreased compared with that of normal rat hepatocytes. Conclusions: Bile duct-ligated rat hepatocytes expressed Bcl-2.Hepatocellular expression of Bcl-2 during obstructive jaundice is an adaptive phenomenon to resist apoptosis by bile salts.
【KEY WORDS】 Hepatocyte apoptosis·Jaundice, obstructive ·Genes, Bcl-2·Rat, Wastar
阻塞性黄疸因胆汁淤积引起胆盐升高,造成肝损害。本研究通过观察正常大鼠及阻塞性黄疸大鼠体外培养肝细胞Bcl-2 mRNA的表达情况，研究其与细胞凋亡的关系,探讨胆盐致肝细胞损害的调控机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只，其中4组为实验组，1组为对照组。全部实验组大鼠均手术游离出胆总管，于肝门部结扎胆总管并切断，远端再予结扎。分别于结扎3 、7 、14 和21 d后处死1组。对照组手术不结扎切断胆总管，14 d处死。
1.2 大鼠肝细胞的分离与培养 采用胶原酶原位肝灌注法［1］获取肝细胞，4%台盼蓝染色判断肝细胞存活率，细胞计数板记数细胞浓度。细胞于合成培养基（RPMI 1640 80 ml，新生小牛血清20 ml，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，胰岛素0.1 U/ml，hepes 15 mmol）培养36 h。培养条件37 ℃，5% CO2。冷冻保存。
1.3 主要试剂 甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）、碘化丙锭（PI）染色剂为Sigma公司产品。TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司提供。Trizol一步法总RNA提取试剂盒和Tag酶由Promega公司提供。Bcl-2引物及β-actin特异性寡核苷酸引物由中科院上海细胞生物研究所合成。Bcl-2的引物序列为Forward Primer：5’￣GT￣CAT￣AAC￣TAA￣AGA￣CAC￣CCC￣3’，Reverse Primer：5’￣TTC￣ATC￣TCC￣AGT￣ATC￣CCA￣CTC￣3’；β-actin的引物序列为Forward Primer： 5’￣TAG￣AAG￣CAT￣TTG￣CGG￣TGC￣ACG￣3’，Reverse Primer： 5’￣TCC￣TG￣CAG￣CAA￣TGC￣CTG￣GGT￣3’［2，3］。
1.4 检测指标
1.4.1 大鼠血清胆红素的测定 对照组和结扎3、7 、14 和21 d组抽血，所有大鼠经门静脉抽血，离心后取上层血清行胆红素测定。
1.4.2 大鼠肝细胞Bcl-2 mRNA表达的检测 分别收集各组大鼠肝细胞1×106 ml-1，用Trizol试剂盒一步法提取肝细胞总RNA,行RT-PCR扩增Bcl-2和对照β-actin基因片段。反应总体积为50 μl，反应条件为94 ℃，5 min→94 ℃，45 s→57 ℃，45 s→72 ℃，1 min，共40个循环，72 ℃最后延伸。每组扩增产物各取10 μl，2%琼脂糖凝胶电泳。拍照后，对Bcl-2及β-actin条带行光密度扫描。以Bcl-2条带与β-actin条带光密度之比作半定量，进行t检验分析，P≤0.05为差异有统计学意义。
1.4.3 大鼠凋亡肝细胞的检测 将对照组及结扎14 d组大鼠的肝细胞按1×106ml-1，1 ml/孔，分别种于内含小飞片的24孔培养板中，培养36 h。加入终浓度为100 μmol/L的GCDC，培养24 h后取出小飞片，行TUNEL检测。同时0.25%胰酶消化培养孔内细胞，行FCM检测。
1.5 统计学处理 应用SAS 8.2版统计软件包行多元方差分析和t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清胆红素水平 对照组和结扎3、7、14和21 d组的胆红素值分别为（1.94±0.46）、（73. 55±15.73）、（105.11±23.36 ）、（128.25±27.43）和（143.27±34.27） μmol/L。各组间差异均有统计学意义（P<0.05），胆红素水平随结扎时间的延长而逐渐增高。
2.2 大鼠肝细胞Bcl-2 mRNA的表达 对照组及结扎3 d组Bcl-2 mRNA的表达为阴性，仅见β-actin条带；结扎7 d组可见Bcl-2 mRNA表达（光密度值=0.14±0.13）；结扎14 d组表达最多（光密度值=0.57±0.22），且与7、21 d组比较差异有统计学意义，P<0.05；结扎21 d组略有下降（光密度值=0.44±0.14）。
2.3 GCDC对大鼠肝细胞凋亡的影响 GCDC作用后，对照组大鼠肝细胞凋亡率较前明显升高（P<0.05）；结扎14 d组大鼠肝细胞凋亡率较前增加但差异无统计学意义（P> 0.05），但与对照组GCDC作用后的凋亡率相比，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表1。
2.4 肝细胞凋亡TUNEL原位检测 TUNEL阳性细胞核着棕黄色。对照组肝细胞可见少数阳性细胞，GCDC作用后见多量阳性细胞弥漫散在，胞质固缩，与邻周细胞脱离、核染色质浓缩。结扎14 d组大鼠阳性细胞有所增加，GCDC作用后，阳性细胞无明显增加。
3 讨论
人类许多疾病和病理生理现象都与细胞凋亡的紊乱有关，凋亡异常增加被认为是肝胆疾病的重要发病机制［4］。本研究发现，在大鼠阻塞性黄疸发生早期，肝脏即出现细胞凋亡，并随着黄疸的加重明显增加，但后期细胞凋亡减少，可能与凋亡调控机制的激活及肝脏纤维组织的增生有关。细胞凋亡是细胞凋亡刺激基因和凋亡抑制基因共同控制的过程。有研究表明，胆盐可致肝细胞的凋亡，可能是阻塞性黄疸肝损害的机制［5］。
Bcl-2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因之一［６－８］，最早从B细胞淋巴瘤染色体14和18异位短裂点t（14；18）（q31-q32）中分离出来。Bcl-2基因蛋白表达产物定位于线粒体膜、核膜和内质网，在其氨基酸C-末端有一由19个氨基酸组成的疏水性片段，并借此与膜相连。通过转基因动物和基因转染实验研究发现，Bcl-2对细胞凋亡具有明显的抑制作用。我们的实验发现，正常大鼠肝细胞不表达Bcl-2 mRNA，结扎胆总管后，肝细胞中有明显的Bcl-2 mRNA的表达，且结扎14 d达高峰。进一步研究GCDC对大鼠肝细胞后凋亡率的影响发现， Bcl-2 mRNA呈高表达的结扎14 d组的肝细胞凋亡率明显低于无Bcl-2 mRNA表达的对照组肝细胞的凋亡率（P<0.05）；而胆总管结扎后14 d大鼠肝细胞经GCDC作用前后凋亡率无显著增加（P>0.05）。本研究结果表明，阻塞性黄疸大鼠肝细胞能够通过Bcl-2基因表达抑制胆盐的致肝细胞凋亡作用，其机制可能是Bcl-2能清除氧自由基保护膜的稳定性，改变细胞内细胞器钙离子内流等［９］；还可能与蛋白激酶C信号通道调节细胞mRNA磷酸化有关［１０］。
【】
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