定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

【摘要】  ［目的］ 制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体，用于重症肌无力的特异性免疫. ［方法］ 应用定点突变技术，将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637的重链CH 2区的第322位氨基酸进行K 322 A突变，获得的突变型抗体IgG 637/K 322 A基因经转化大肠杆菌XL 1-Blue进行增殖，测定序列证实为突变序列，转染哺乳类细胞CHO-k 1进行表达，其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C 1 q的结合活性. ［结果］ 突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合，而对照抗体IgG 637可与补体结合. ［结论］ 经定点突变，成功地获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.

【关键词】  受体，胆碱能；重症肌无力；点突变；补体结合；抗体

    ABSTRACT: OBJECTIVE To develop an immunoglobulin-like anti acetylcholine receptor (AChR) antibody without complement binding activity, which  can be used in the specific immunotherapy for myasthenia gravis.  METHODS A pathogenic anti AChR  antibody IgG 637,  previously made in our laboratory, was  mutated in the key site of complement C 1 q binding  K 322 A  by site directed mutagenesis  technology. The genes of mutant IgG 637/K 322 A  were then transformed into E coli  XL 1 Blue for cloning,  sequencing and furthermore transinfected into mammalian cell line CHO k 1 for expression. The complement C 1 q-binding activity of expressed products IgG 637/K 322 A  was determined in enzyme linked immunosorbent assay  (ELISA)  by using pig anti human  C 1 q  monoclonal antibody. RESULTS The  mutant  IgG 637/K 322 A was not able to bind complement C 1 q  in ELISA, whereas, the control  antibody  IgG 637  could  bind  C 1 q  in a concentration dependent manner.  CONCLUSION  The immunoglobulin like anti AChR antibody without complement binding activity is successfully made from a pathogenic anti AChR antibody IgG 637  by  site directed mutagenesis.

    Key words:receptor,  cholinergic;myasthenia  gravis;point  mutation;complement-binding;antibodies

    重症肌无力是由抗乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫病，而致病性抗乙酰胆碱受体抗体多为IgG类抗体，它的2个抗原结合片段（Fab）与神经肌肉接头处突触后膜上相邻的2个乙酰胆碱受体结合，可加快乙酰胆碱受体的内化作用（即抗原调变）；也可通过其可结晶片段（Fc）激活补体的C 1 q成分，经过级联反应形成C 5-C 9膜攻击复合体，导致乙酰胆碱受体被破坏，出现肌肉收缩无力等症状［1］.由致病性抗乙酰胆碱受体抗体制备的单链抗体因具有单价结合性，不能引起抗原调变，又因缺乏Fc段而不能激活补体，但仍能与乙酰胆碱受体结合，从而封闭致病性抗体与乙酰胆碱结合，对乙酰胆碱受体具有保护作用，可用于重症肌无力的治疗［2］.但单链抗体分子质量小，稳定性差，在应用前需进行基因工程加工处理，以延长在血中的半寿期.随着分子生物学技术的飞速和抗体工程技术的不断进步，使制备大分子质量且稳定的单价抗乙酰胆碱受体抗体成为可能.本研究利用定点突变技术，从完型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637制备了不能激活补体的突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637/K 322 A，为最终制备出可用于治疗重症肌无力的无补体激活功能的单价抗乙酰胆碱受体抗体提供依据.

    1  材料与方法

    1.1  菌种与试剂  大肠杆菌XL 1-Blue由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供，定点突变试剂盒（Quick  Change XL Site-Directed Mutagenesis Kit）为美国Stratagene公司产品，质粒纯化试剂盒为德国Qiagen公司产品，猪抗人C 1 q单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪Fab段抗体均为德国Roche Molecular Biochemicals公司产品.

    1.2  pIgG 1- 637的构建  应用PCR技术从载体pComb 3-Fab 637中扩增Fab 637基因，克隆至载体pIgG 1，构建能在哺乳类细胞表达完型抗体IgG 637的重组表达载体pIgG 1- 637［3］.

    1.3  IgG 637重链K 322 A的PCR定点突变  根据IgG 1的CH 2区基因序列（GenBank AF 237583）设计K 322 A的引物为：5′-G GAG TAC AAG TGC GCG GTC TCC AAC AAA GCC C-3′（划线部分为引入突变的碱基）以及其互补引物.在50 μL  PCR总反应体积中，含有10 ng  pIgG 1- 637，1.3 μL  K 322 A引物和互补引物（10 μmol/L）、1 μL  PfuTurbo  DNA聚合酶（2.5 U）.在PCR仪中进行18次循环，扩增前95 ℃预变性1 min，循环后在68 ℃延伸7 min.每个循环为95 ℃变性50 s，60 ℃退火50 s，68 ℃延伸26 min.应用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果.

    1.4  转化大肠杆菌XL 1-Blue  直接在PCR反应管中加入含1 μL  DpnⅠ的NZY肉汤培养基（10 g/L干酪素水解物、5 g/L酵母浸出物及5 g/L氯化钠，pH值为7.5，使用前每升内加入1 mol/L氯化镁12.5 mL、1 mol/L硫酸镁12.5 mL及2 mol/L葡萄糖10 mL），37 ℃震荡孵育（250 r/min）1 h.涂布接种于含有氨苄青霉素（100 mk/L）的LB琼脂培养基（10 g/L蛋白胨、10 g/L氯化钠、5 g/L酵母浸出物及20 g/L琼脂，pH值为7.0，使用前30 min在表面涂布100 g/L  X-gal  20 μL,100 mmol/L  IPTG 20 μL），37 ℃过夜孵育.选择蓝色菌落接种于LB肉汤培养基，以质粒纯化试剂盒提取和纯化质粒DNA，测定序列,以证明定点突变是否成功，得到突变抗体plgG 1- 637/K 322 A.

    1.5  载体pIgG 1- 637/K 322 A在哺乳类细胞的表达  载体pIgG 1- 637/K 322 A经SalⅠ酶切线性化处理，与FuGENE  6转染试剂混合，转染CHO-k 1细胞，以MSX筛选出最高表达克隆株进行有限稀释并扩大培养及纯化，得到突变抗体IgG 637/K     322 A［3］.

    1.6  突变抗体IgG 637/K 322 A的补体结合性测定  采用酶联免疫吸附试验（ELISA）［4］.将表达并纯化的突变抗体IgG 637/K 322 A包被96孔反应板，以小牛血清白蛋白封闭，用1∶50倍稀释的正常人血清作为补体的来源，以猪抗人C 1 q单克隆抗体与补体结合，再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪Fab段抗体显色.在波长为415 nm处测定吸光值(A值)，以未经突变的抗体IgG 637作为对照抗体.

    抗乙酰胆碱受体抗体IgG 637重链CH 2区基因经定点突变技术得到突变K 322 A，测定序列证实第322位氨基酸已经从赖氨酸（K）突变为丙氨酸（A）.重组的突变抗体载体基因IgG 1- 637/K 322 A在哺乳类细胞稳定表达后，获得突变抗体IgG 637/K 322 A.经ELISA检测结果表明，突变抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合，而未突变的对照抗体IgG 637可与补体C 1 q结合，且随着抗体浓度的升高结合能力亦增强（Fig 1）.

    Fig 1  Complement C 1 q-binding activity of pathogenic anti-acetylcholine receptor antibody IgG 637 and its mutant IgG 637/K 322 A

    3  讨论

    理想的对抗重症肌无力的免疫方法应该是只抑制机体针对特异性抗原乙酰胆碱受体的免疫应答，而对其他的免疫反应不产生影响.目前对重症肌无力的特异性免疫治疗方法很多，但大多数仍处于动物实验阶段.本实验室在研究单链抗体对重症肌无力的特异性治疗作用时发现，单链抗体对乙酰胆碱受体具有保护作用，但因它半寿期短，限制了临床实际应用［2］.将单链抗体与人血清白蛋白连接，构建单链抗体-人血清白蛋白融合蛋白，以提高单链抗体在血清中的稳定性，可能是解决单链抗体半寿期短的办法之一［5］.如果能制备出与完型人免疫球蛋白IgG具有相同血清半寿期、单价抗原结合价（不具备抗原调变功能）及无补体激活能力的免疫球蛋白IgG样分子，则有望通过其封闭致病抗乙酰胆碱受体抗体与抗原结合，达到治疗重症肌无力的目的.致病性抗乙酰胆碱受体IgG类抗体因具有可与乙酰胆碱受体结合及长半寿期等特点，成为制备具有治疗重症肌无力作用的候选免疫球蛋白IgG样分子.由致病性IgG类抗体制备具有治疗作用的免疫球蛋白IgG样分子需要经过2个步骤改造，即去除补体结合能力，以防止补体激活引起乙酰胆碱受体损伤；使1个抗体Fab段的抗原互补决定区（CDR）功能失去活性，以防止抗原调变.应用定点突变技术可改造抗体激活补体的能力及互补决定区结合抗原的能力［6，7］.本实验室曾从抗乙酰胆碱受体抗体的Fab 637制备出完型致病性抗体IgG 637［3］.本研究根据IgG抗体的补体结合区氨基酸排列［8］，应用定点突变技术［9］，对IgG 637的重链CH 2区与补体结合的关键部位，即第322位氨基酸进行了2个核苷酸的突变，使原来的赖氨酸（K）经突变后成为丙氨酸（A）,得到突变型抗体IgG 637/K 322 A,转化大肠杆菌XL 1-Blue，纯化后经核苷酸序列测定证实其序列为突变型；再经哺乳类细胞表达，应用ELISA检测突变型抗体IgG 637/K 322 A与补体C 1 q的结合活性，结果表明突变型抗体IgG 637/K 322 A不能与补体C 1 q结合，而对照抗体IgG 637可与补体C 1 q结合，表明已经成功获得了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.这一抗体将在下一步的实验中作为原材料用于抗体互补决定区的定点突变，以获得单价免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体，最终用于重症肌无力的特异性免疫治疗.

【】
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［3］ 杨康鹃，孟繁平，魏晶，等.重症肌无力致病性自身抗体的人工构建［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006,26(8):718.

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