实验性脑出血动物模型的研究现状

【摘要】  本文对实验动物选择、胶原酶诱导法脑出血模型、自体血注入法脑出血模型、微球囊充胀法脑出血模型和自发性脑出血模型的制作方法、病理生和各自的优缺点作一综述。

【关键词】  脑出血；动物模型；综述

    高血压脑出血是一种临床常见的、病死率和致残率都较高的重症疾病，缩短了人类的预期寿命和降低了患者的生活质量。由于很多研究脑出血损伤机制及防治的方法都是损伤性的，故脑出血动物模型是国内外研究脑出血疾病的必要工具，且研究脑出血的损伤机制、神经功能的恢复以及相关的策略须选择适合的模型。本文就各种实验性脑出血动物模型的制作方法、病理生理学和各自的优缺点作一综述。

    1  实验动物的选择

    根据研究目的不同须采用不同的动物制作脑出血模型：大动物如猫、猪、猴、犬等脑体积较大，更适用于研究脑出血占位效应及血肿清除效果，如猪脑叶出血模型大量用于白质损伤、外科血肿清除技术、周围水肿的形成、病理生理和治疗学上的研究［1-3］；小型动物，如兔、大鼠、小鼠等，适用于研究组织形态和病理机制，其中以SD大鼠最为常用［4］；转基因或基因敲除鼠类则在研究细胞反应、细胞因子的效应、基因调控损伤机制等方面具有优越性［5-6］。

    2  4种实验性脑出血模型

    2.1  胶原酶诱导法脑出血模型

    胶原酶是一种金属蛋白酶，可以分解细胞间基质及血管基底膜上的胶原蛋白，主要分布人体的脑血管周围，存在于巨噬细胞和单核细胞内。病理情况下其可以从细胞中释放出来并被激活。Rosenberg等［7］于1990年建立的胶原酶诱导脑出血模型已被广泛采用。他们在立体定向仪下用微量泵向大鼠尾状核注入含0.01～1.00 UⅦ型细菌胶原酶的生理盐水2 μL，9 min内完成的实验中发现注入0.5 U胶原酶的出血模型脑出血点周围可见明显水肿，且大鼠几乎都可以存活，他们认为0.5U胶原酶诱导的脑出血模型适合于实验研究。

    将胶原酶注入小鼠尾状核后，小鼠即出现脑内血肿和对侧上下肢瘫痪，行走呈“划圈样”向同侧转圈，神经功能缺失症状在12　h最明显，光镜下术侧尾状核可见明显的出血区，其中的细胞几乎全部坏死、周围神经元数目明显减少和基质水肿，形态学证实出血的高峰时间与肢体偏瘫症状的过程基本一致［8］。注射胶原酶4 h后，血肿周围可见粒细胞浸润，第3天粒细胞水平达到峰值［9］，1～3 d血肿边缘的神经缺失并伴有小胶质细胞和巨噬细胞的积聚和激活［10］，提示粒细胞的浸润、小胶质细胞和巨噬细胞的积聚和激活均可能引起或加重脑出血后继发的脑损害。张花先等［11］观察到注射Ⅶ型胶原酶的大鼠术后神经功能改变与人脑出血类似，可造成长期的运动缺陷，可用于研究脑出血后神经功能的恢复及评价药物疗效。

    胶原酶诱导脑出血模型的制作方法具有简单、快捷、重复性好，与人脑出血的病理、生化及病理生理有许多相似性［8］，且出血区面积的大小可以控制的优点，但由于出血主要以弥漫性出血为主，不能形成真正意义上的血肿，且出血灶中常混有正常脑组织与临床自发性脑出血的发病不同，故该模型较适用于研究血肿及脑水肿在脑出血中的作用及评价脑出血后神经功能的恢复状况和药物的治疗效果。

    2.2  自体血注入法脑出血模型

    脑内直接注入自体血是最经典的脑出血模型。自20世纪60年代开始，人们采用向脑内特定区域注入自体血的方法制作了狗、猴、兔和猫等大型脑缺血动物模型。立体定向技术问世以后，人们开始利用立体定向仪将自体血准确注入大鼠尾状核进行系列研究［12］。注血量的多少应根据动物脑体积的大小而定，Nath等［13］采用的鼠脑注血量分别为25、50和100 μL，分别相当于人脑20、40和80 mL的出血量，这是造成临床上不同严重程度脑出血的出血量。由于自体血注入的造模方法操作简单，特别是应用立体定向仪后，动物的死亡率明显降低，且血肿位置更加精确，除有不可避免的穿刺针道损伤外无其他物质，故该法造出的脑出血模型的病理过程更接近人。

    在用该法制作的脑出血模型进行的研究发现，脑出血后的继发性脑损害和脑水肿形成的机制是多方面的。脑出血后24　h，基质金属蛋白酶2（MMP-2）开始表达，于第6天达到高峰，第10天仍维持高水平表达，而基质金属蛋白酶9（MMP-9）在脑出血后6 h开始表达，24　h～3　d最明显，此后活性逐渐降低，第15天时不再表达［14］。在MMP-9缺乏的大鼠脑出血模型中，神经凋亡、小神经胶质活化、中性粒细胞蓄积这些病理损害均有所减轻，而用凝血酶特异性抑制剂水蛭素拮抗凝血酶后也会减轻上述病理损害［15］。张颖等［16］也证实了脑出血急性期凝血酶可能破坏血肿周围组织微管相关蛋白-2（MAP-2）而致病。以上说明脑出血后MMP-9的活性增高可能与急性期脑水肿的形成有关，而MMP-2的迟发表达还可能同时参与了脑组织的修复过程。脑出血后尽早抑制凝血酶及MMP-9的神经毒性作用有助于改善脑出血的预后。Masuda等［17］观察到脑出血后脑含水量48　h时达高峰，炎性浸润和TNF-α、IL-6及NF-κB的免疫阳性反应细胞的最大值也出现在48　h，而细胞间黏附分子-1 （ICAM-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、C3和CR2的表达则在72　h时达到最高峰，这提示炎症细胞因子、血管内皮细胞生长因子以及补体系统在脑出血后的脑水肿及神经损伤的发展中起作用。景文莉等［18］发现家兔内囊出血后迷走神经干放电活动强度和放电频率比出血前明显增高，考虑为颅内压增高后压迫第4脑室或引起脑干、下丘脑等的牵拉、扭曲，直接刺激迷走神经核所致。

    自体血注入法不仅可以通过控制注血量作不同程度脑出血的实验性研究，而且注入的血是非肝素化自体血，可观察到血液凝固过程中释放的血管活性物质对脑循环及脑组织的影响，与临床脑出血的过程较接近，适合于脑实质出血的过程、病理形态学等特点的研究，还可更好地观察血液凝固过程中各种因子对脑组织代谢和血流的影响，为临床治疗提供一定依据［19］。

    2.3  微球囊充胀法脑出血模型

    Sinar等［20］向脑内插入一微球囊，用生理盐水或造影剂充盈球囊，可产生类似于人脑出血时血肿压迫周围脑组织并使颅内压升高的状况，这是一种纯机械的脑出血模型制作方法。其优点在于球囊内液体量可人为控制，能产生一致的、可重复的脑损害，避免了自体血注入法出现血液进入蛛网膜下腔或破入脑室以及血肿形态不一的缺陷，较易观察血肿清除后的效应。此类模型在20世纪七八十年代应用较多。理论上该模型为研究自发性脑出血产生的占位效应和血肿清除后的病理生理变化、局部脑血流改变、颅内压力变化提供了手段，可用来评价早期清除血肿后神经功能的改变。故有人利用微球囊充气和放气模拟手术清除血肿过程，研究血肿清除术治疗的时间窗及对临床疗效的影响［21］。但此模型不同于真正意义上的脑出血，没有血液成份，不能模拟血液本身的成份在脑出血后脑损伤及脑水肿形成与发展中所起的重要作用，观察不到脑出血所引起的细胞毒性反应，因此该类脑出血模型在近年已较少采用［22］。

    改变遗传基因获得的自发性高血压大鼠（SHR）有易卒中型，其亚种（SHRSP）被认为是目前研究高血压动脉硬化性脑卒中较理想的动物模型。但SHRSP有严格的遗传局限性，饲养困难，易变种或断种，发生脑出血时的出血量不易控制，出血区域无法选择，价格昂贵和来源困难等也限制了其在实验性脑出血研究中的应用。黄如训等［23］用内径0.30　mm的银夹钳夹大鼠的双侧肾动脉，使双肾动脉缩窄造成肾血管性高血压的RHRSP大鼠模型，其血压峰值高、能稳定在200 mmHg以上，可并发与人高血压病类似的脑动脉损害及各种类型的脑出血。该模型易于建立，价格低廉，且有与人脑出血相似的高血压动脉硬化病理生理基础，但与SHRSP相比，其自发性脑出血的发生率较低，出血量及出血区域也同样无法控制。周爽等［24］在双肾双夹法复制RHRSP大鼠模型的基础上，运用胶原酶加肝素脑内注射诱发脑出血建立的高血压脑出血大鼠模型具有造模时间短、卒中类型及出血部位恒定、重复性好等优点。

    3  展望

    以上方法所造的实验性脑出血动物模型各有优缺点，说明脑出血动物模型的建立还有待完善。目前仍缺乏既有类似人高血压、动脉硬化病理生理基础的，又接近人脑出血发病情况且出血量及出血部位均有较好重复性的脑出血动物模型。脑出血恢复期的动物模型则更加缺乏。制造出具有自发性的、稳定的、易于成功复制的、便于定量研究的脑出血动物模型仍是今后脑出血模型的研究方向。将自发性脑出血与人工诱导脑出血模型的优点结合起来并加以改进，将有可能制作出较理想的脑出血动物模型。

【】
  ［1］ Schwarz S, H?fner K, Aschoff A, et al. Incidence and prognostic significance of fever following intracerebral hemorrhage［J］. Neurology, 2000, 54(2): 354-361.

［2］ Wagner K R, Hua Y, de Courten-Myers G M, et al. Tin-mesoporphyrin, a potent heme oxygenase inhibitor, for treatment of intracerebral hemorrhage: in vivo and in vitro studies［J］. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2000, 46(3): 597-608.

［3］ Wu J, Hua Y, Keep R F, et al. Iron and iron-handling proteins in the brain after intracerebral hemorrhage［J］. Stroke, 2003, 34(12): 2964-2969.

［4］ 张朋奇,朱贤立,赵甲山,等.一种大鼠脑内出血模型的建立与评价［J］.临床神经外科杂志, 2005,10(1):33-35.

［5］ Belayev L, Saul I, Curbelo K, et al. Experimental intracerebral hemorrhage in the mouse: histological, behavioral, and hemodynamic characterization of a double-injection model［J］. Stroke, 2003, 34(9): 2221-2227.

［6］ Nakamura T, Xi G, Hua Y, et al. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice［J］. J Cereb Blood Flow Metab, 2004, 24(5): 487-494.

［7］ Rosenberg G A, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats［J］. Stroke, 1990, 21(5): 801-807.

［8］ 许东,文玉军,张莲香,等.胶原酶注入小鼠尾状核建立脑出血模型［J］.中国实验动物学报, 2006, 14(1): 36-39.

［9］ Wang J, Tsirka S E. Neuroprotection by inhibition of matrix metalloproteinases in a mouse model of intracerebral hemorrhage［J］. Brain, 2005, 128 (Pt 7): 1622-1633.

［10］ Wasserman J K, Schlichter L C. Neuron death and inflammation in a rat model of intracerebral hemorrhage: effects of delayed minocycline treatment［J］. Brain Res, 2007, 1136(1): 208-218.

［11］ 张花先,黎杏群,梁清华,等.采用Ⅶ型胶原酶建立出血性中风中经络大鼠模型［J］.湖南中医学院学报,2004,24(4):1-3.

［12］ 刘胜达,周志明,吴家幂.立体定向技术制作大鼠脑出血模型评价［J］.中国航天医药杂志, 2003, 5(1):31-32.

［13］ Nath F P, Jenkins A, Mendelow A D, et al. Early hemodynamic changes in experimental intracerebral hemorrhage［J］. J Neurosurg, 1986, 65(5):697-703.

［14］ 田力,刘海峰,滕伟禹.大鼠实验性脑出血后基质金属蛋白酶2和9的表达［J］.中国动脉硬化杂志, 2006, 14(3):221-223.

［15］ Xue M, Hollenberg M D, Yong V W. Combination of thrombin and matrix metalloproteinase-9 exacerbates neurotoxicity in cell culture and intracerebral hemorrhage in mice［J］. J Neurosci, 2006, 26(40): 10281-10291.

［16］ 张颖,冯加纯,戈亚平.实验性脑出血急性期凝血酶致病机制的探讨［J］.中国神经精神疾病杂志, 2006, 32(1): 60-62.

［17］ Masuda T, Hida H, Kanda Y, et al. Oral administration of metal chelator ameliorates motor dysfunction after a small hemorrhage near the internal capsule in rat［J］. J Neurosci Res, 2007, 85(1): 213-222.

［18］ 景文莉,张向群,金学隆.家兔内囊出血模型制作及出血后颅内压和迷走神经放电变化的研究［J］.陕西医学杂志, 2007, 36(1): 18-21.

［19］ 张祥建,刘春燕,祝春华,等.大鼠自体动脉血脑出血动物模型的建立［J］.脑与神经疾病杂志, 2003, 11(6):341-344.

［20］ Sinar E J, Mendelow A D, Graham D I, et al. Experimental intracerebral hemorrhage: effects of a temporary mass lesion［J］. J Neurosurg, 1987, 66(4): 568-576.

［21］ Lopez-Valdes E, Hernandez-Lain A, Calandre L, et al. Time window for clinical effectiveness of mass evacuation in a rat balloon model mimicking an intraparenchymatous hematoma［J］. J Neurol Sci, 2000, 174(1):40-46.

［22］ Nehls D G, Mendelow D A, Graham D I, et al. Experimental intracerebral hemorrhage: early removal of a spontaneous mass lesion improves late outcome［J］. Neurosurgery, 1990, 27(5):674-682.

［23］ 黄如训,曾进胜,苏镇培,等.易卒中型肾血管性高血压大鼠模型［J］.中国神经精神疾病杂志, 1991, 17(5):257-260.

［24］ 周 爽,方邦江,孙国杰.一种高血压性脑出血动物模型的建立及评价［J］.医学理论与实践, 2004, 17(2):127-129.