膈下逐瘀汤对肝硬化大鼠NO、ET-1及TXB2、6-Keto-PGF1α含量的影响
【摘要】 目的 观察膈下逐瘀汤对肝硬化大鼠一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）及血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）含量的影响。方法 将50只SD大鼠随机分为5组，正常对照组、模型对照组、膈下逐瘀汤高剂量组、膈下逐瘀汤低剂量组、复方鳖甲软肝片组各10只。除正常对照组外，其余各组采用四氯化碳(CCl4)、普通饮食及乙醇建立大鼠肝硬化模型。造模成功后，各组分别予相应药物灌胃，正常对照组、模型对照组予0.9%氯化钠注射液，灌胃容积均为1 mL/只，每日给药1次，连续灌胃4周。检测各组ET-1、NO、TXB2、6-Keto-PGF1α的含量，并进行统计分析。结果 膈下逐瘀汤高剂量组ET-1、NO、TXB2、6-Keto -PGF1α明显降低，与模型对照组、复方鳖甲软肝片组、膈下逐瘀汤低剂量组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。结论 膈下逐瘀汤可通过有效地抑制NO、ET-1的产生，恢复血管平滑肌的正常舒缩状态，改善肝脏血流动力学；可显著降低肝硬化大鼠血清TXB2和6-Keto-PGF1α含量，调节二者的比例，使其达到适宜的有效浓度，以消除血小板聚集和血栓形成，改善肝脏微循环。
【关键词】 膈下逐瘀汤 肝硬化 动物 试验 大鼠 一氧化氮 6-酮-前列腺素F1α
Effect of Gexiazhuyu decoction on the levels of NO,ET-1,TXB2 and 6-Keto-PGF1α in rats with hepatic cirrhosis
【Abstract】 Objective To observe the effect of Gexiazhuyu decoction on the levels of NO, ET-1, TXB2 and 6-Keto-PGF1α in rats with hepatic cirrhosis. Methods The rat models with hepatocirrhosis were established with seretin, routine diet and alcohol. After the models were successfully set up, the rats were divided into normal control group, model control group, high-dose Gexiazhuyu decoction group, low-dose Gexiazhuyu decoction group and compound Biejiaruangan tablets group. The levels of ET-1, NO, TXB2, 6-Keto-PGF1α were detected and statistics analysis was conducted. Results The levels of ET-1, NO, TXB2,6-Keto -PGF1α in high-dose Gexiazhuyu decoction group was significantly lower than those in other three groups (P<0.05 or P<0.01). Conclusion Gexiazhuyu decoction can recover the normal diastolic and contractile state of vascular smooth muscle, and improve the hemodynamic of liver by inhibiting effectively the generation of No and ET-1. Gexiazhuyu decoction can reduce considerably the content of serum TXB2 and 6-Keto-PGF1α; regulate the ratio of the two factors to suitable effective concentration, in order to eliminate the aggregation of blood platelet and thrombosis as well as improve micro circulation of liver.
【Key words】 Gexiazhuyu decoction; Hepatocirrhosis; Animal; Trial; Rats; NO；6-Keto-PGF1α
肝硬化是一种慢性进行性弥漫性肝脏疾病，是由一种或多种病因长期或反复作用引起的肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴肝细胞结节状再生。中医中虽然未见肝硬化的病名，但根据其症状、体征，属中医学胁痛、积聚、疒徵瘕、臌胀、单腹胀、蜘蛛蛊等范畴。瘀血阻络、肝脾失调是其主要病机特点，尤其是瘀血阻络贯穿于肝硬化的整个病程之中。因此，观察活血化瘀方药肝硬化的疗效，探求其作用机制具有重要的临床意义。为研究活血化瘀方药治疗肝硬化的作用机制，探索古方新用，笔者采用复合因素造模法复制了肝硬化大鼠模型，通过观察膈下逐瘀汤对内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）的影响，探讨了其对改善肝脏微循环的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SD健康大鼠50只，体质量180～200 g，雌雄各半，由河南安阳华兴实验动物养殖场提供，动物合格证号：20030326。
1.1.2 实验药物 膈下逐瘀汤药物组成：五灵脂（炒）、川芎、牡丹皮、赤芍药、乌药各6 g，延胡索3 g，红花、桃仁、当归、甘草各9 g，香附、枳壳各4.5 g。水煎浓缩至实验所需的浓度。 复方鳖甲软肝片由内蒙古福瑞制药有限责任公司提供，国药准字（1999）Z-102号，实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。
1.1.3 主要试剂 NO试剂盒（批号：20031125）由南京建成生物工程研究所提供；ET-1试剂盒（批号：20031122）、6-Keto-PGF1α放免药盒（批号：20031128）、TXB2测定试剂盒（批号：20031123）均由人民解放军总科技开发中心放免研究所提供；60%四氯化碳(CCl4）植物油（石家庄市新华制药厂，批号：20031128）。
1.1.4 仪器 LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（泰克仪器有限公司），LEICA RM2125型切片机（德国LEICA公司），OLYMPUS VANOX PM-10AD型显微照相仪（日本OLYMPUS公司），全自动生化分析仪（美国Beckman公司），MSE-25型高速冷冻离心机（上海安亭仪器厂），XH-6020γ放射免疫计数仪。
1.2 实验方法
1.2.1 造模及给药方法 将SD大鼠50只随机分为5组，即正常对照组、模型对照组、膈下逐瘀汤低剂量组、膈下逐瘀汤高剂量组、复方鳖甲软肝片组各10只。参照文献［1］，除正常对照组外，其余各组于每周四、周日按0.03 mL/kg体质量给每只大鼠皮下注射60% CCL4植物油, 每周测体质量1次以调整剂量。以 5%乙醇为惟一饮料，均给普通饲料，自由进食。10周后确定肝硬化形成，停用CCL4及乙醇。造模成功后开始灌胃。膈下逐瘀汤高、低剂量组每只分别给予膈下逐瘀汤2.6、1.3 g/kg（分别相当于成人剂量的20倍、10倍），每日1次；复方鳖甲软肝片组予复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃，用药剂量为1.2g/kg（相当于成人剂量的20倍），每日1次；正常对照组、模型对照组予0.9%氯化钠注射液1 mL，每日1次。以上各组灌胃量均为1 mL，连续灌胃4周。
1.2.2 检测项目 于最后1次给药后禁食12 h，将大鼠用25%乌拉坦0.4 mL/100 g腹腔麻醉后，仰位固定于手术台上，腹正中切口，腹主动脉取血，先用一试管取血1 mL后，将血样迅速低温离心，分离血清，取血清适量，密封，-20℃冷存待检。再用一试管取血1 mL，抑肽酶抗凝后，迅速低温离心，分离血浆，取血浆适量，密封，-20℃冷存待检。ET-1采用放射免疫法，NO采用硝酸还原酶法，TXB2和6-Keto-PGF1α均采用放射免疫法测定。
1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析、Newman-Keuls检验。
2 结果
2.1 各组大鼠血清NO和ET-1比较 见表1。
表1 各组大鼠血清NO和ET-1比较（略）
与正常对照组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与膈下逐瘀汤低剂量组比较，＃P<0.05；与复方鳖甲软肝片组比较，▲P＜0.01
由表1可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清ET-1、NO有明显增高（P＜0.01)；与模型对照组比较，膈下逐瘀汤高、低剂量组及复方鳖甲软肝片组ET-1、NO明显降低(P＜0.05，P＜0.01)。模型对照组与正常对照组比较ET-1、NO明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01)。经膈下逐瘀汤及复方鳖甲软肝片治疗后，ET-1、NO明显降低，与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01)；膈下逐瘀汤高、低剂量组均优于复方鳖甲软肝片组(P＜0.01)；膈下逐瘀汤高剂量组优于低剂量组(P＜0.05)。
2.2 各组大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α比较 见表2。
表2 各组大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α比较（略）
与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与膈下逐瘀汤低剂量组比较，＃P<0.05；与复方鳖甲软肝片组比较，▲P＜0.01
由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠的血清TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α明显增高（P＜0.01)；与模型对照组比较，膈下逐瘀汤高、低剂量组及复方鳖甲软肝片组明显降低(P<0.05，P＜0.01)。模型对照组与正常对照组比较TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01)。经膈下逐瘀汤及复方鳖甲软肝片后，TXB2、6-Keto-PGF1α、TXB2/6-Keto-PGF1α明显降低，与模型对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.01)；膈下逐瘀汤高、低剂量组均优于复方鳖甲软肝片组(P＜0.01)；且膈下逐瘀汤高剂量组优于低剂量组(P＜0.05)。
3 讨论
肝硬化多由感受湿热疫毒，复因酒食不节、情志失畅等，迁延日久，肝、脾、肾俱损，气血相互搏结而成，故瘀血阻络、肝脾失调是其主要病机特点。近年来随着肝病中西医结合研究的进展，对肝硬化瘀血阻络的病机特点已取得共识。如姜春华认为肝病主要是血瘀引起气滞，故治疗首先应考虑活血，兼顾理气，治法以活血化瘀为主［2］。印会河认为肝硬化是诸多因素引起血瘀，血瘀导致气滞［3］。因此，肝硬化的病机核心是血瘀引起气滞，所以在治疗时首先考虑活血，兼顾理气。活血化瘀应贯穿于肝硬化治疗的全过程。
膈下逐瘀汤为清代医家王清任创制的名方,载于《医林改错》中，功能活血祛瘀，行气止痛。主治膈膜以下及上腹部瘀血、积块等病证。方中当归、川芎、桃仁、牡丹皮、赤芍药、红花活血祛瘀，通利血脉；乌药、香附、枳壳行气散结,疏达气机；延胡索、五灵脂行血止痛；甘草调和诸药，益气和中。诸药合用，气行则血活，瘀消则块散。
ET和NO是血管内皮细胞合成与释放的一对相互拮抗的生物活性因子。ET-1是目前已知作用最强的血管收缩物质。生理状态下ET-1能被迅速降解，以防止血管的过度收缩。肝硬化时ET-1的合成释放过多，作用于血管和肝脏ET受体。ET-1的合成及释放增加，导致血管收缩，肝窦内灌流减少，肝脏微循环障碍，肝损伤加重。NO作为介质、信使或细胞调节因子，可舒张血管，抑制平滑肌增殖和血小板黏附等，参与机体的许多生物活动和病理过程，与多种疾病的发生和关系密切。ET和NO作为2种生理效应相互拮抗的血管活性物质，相互依赖，肝硬化的发生和发展可能与这种平衡的破坏有关。黄永辉等［4］推测，肝硬化患者内毒素促使NO释放增加→有效血容量降低→ET分泌增加→门脉压力增高→加重肝肾缺血和门体分流→内毒素进入体循环增多之间形成恶性循环，这是造成肝硬化患者肝功能进一步失代偿及产生多种严重并发症的重要原因之一。
TXB2和6-keto-PGF1α分别为血栓素A2(TXA2)和前列腺素（PGI2）的代谢产物。由于PGI2、TXA2不稳定，目前难以直接测定。TXA2主要是由血小板微粒体合成并释放的一种具有强烈促进血管收缩和血小板聚集的生物活性物质。PGI2是由血管壁内皮细胞合成并释放的一种抗血小板聚集和舒张血管的生物活性物质。在正常情况下，TXA2与PGI2保持动态平衡，彼此协调，相互依存，以维持血管壁张力和局部有效血容量。且可减少出血，防止血栓形成等。肝硬化时患者TXA2/PGI2失调，表现为PGI2、TXA2升高或降低，使肝细胞缺血坏死，血管收缩痉挛，血流缓慢，可使病变的肝组织进一步缺血，肝脏微循环障碍，常被认为是临床血瘀证发生发展的重要原因［5］，还可进一步加重原有的肝脏病变。提示血液动力学和肝脏微循环的变化与肝硬化的形成密切相关。因此，在治疗时应积极设法改善血流动力学和肝脏微循环，对提高疗效具有重要的意义。肝硬化时由于胶原纤维增生沉积假小叶生成，血管床缩小、闭塞或扭曲，血管受到挤压，导致肝脏血流动力学异常和微循环障碍，促使病情进一步发展加重。
膈下逐瘀汤可通过降低ET-1、NO含量，调节血管平滑肌收缩与弛张状态，改善血管张力和血流动力学。本项研究结果显示，采用复合因素复制的肝硬化大鼠模型，其血浆ET-1和血清NO含量较正常对照组明显升高（P＜0.01），表明在肝硬化发生、发展过程中，组织缺血缺氧导致血管内皮损伤，NO与ET-1合成与释放增多，从而导致血管收缩，血液循环障碍，又进一步加重了肝硬化的肝损伤过程。经治疗，膈下逐瘀汤高、低剂量组及复方鳖甲软肝片组大鼠血清中ET-1和NO的含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），说明膈下逐瘀汤对ET-1、NO的释放均有抑制作用；膈下逐瘀汤高、低剂量组对大鼠血浆中ET-1和血清NO的影响与复方鳖甲软肝片组比较均有统计学意义（P＜0.01）；而且膈下逐瘀汤高、低剂量之间，呈现很好的量效关系（P＜0.01）。
膈下逐瘀汤可有效调节TXB2和6-Keto-PGF1α含量和比例，改善机体血液运行状态。本项研究结果显示，采用复合因素复制的肝硬化大鼠模型，其血浆中TXB2和6-Keto-PGF1α的含量及其比值均较正常组明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。经过治疗，各组TXB2、6-Keto-PGF1α均有不同程度下降，提示可通过影响TXB2与6-Keto-PGF1α这些参与周围循环的细胞因子，调节由TXA2/PGI2平衡失调引起的血小板聚集、血管痉挛收缩、血栓形成和微循环障碍等改变，以促进肝脏血运，改善肝脏微循环，恢复肝组织的正常功能状态，进而达到抗肝硬化的目的。
【】
［1］ 吴孟超,杨光顺.大鼠肝硬变模型复制的研究［J］.中华实验外科杂志，1984，1(4)：145-147.
［2］ 招萼华.肝硬化病先瘀后滞,主以化瘀攻补配合:姜春华教授诊治疑难病临床经验之二［J］.中医函授通讯,1995,14(3):32-34.
［3］ 张忠会.印会河教授治疗肝病的经验［J］.国医,1990,5(5):21-22.
［4］ 黄永辉,周力,张晓蕾,等.肝硬化患者血浆一氧化氮及内皮素改变的初步研究［J］.中华内科杂志,1996,35(7):479.
［5］ 鄢毅,李国贤,袁景珊,等.血瘀证目征机理研究［J］.中西医结合杂志,1996,16(4):213-215.
