COX?2抑制剂联合顺铂或X射线对A549肺腺癌细胞株的体外实验

             作者：熊建萍,陶庆松,张凌,徐俊,项小军,李思明,张锡泉,卢珊

【摘要】  目的 观察环氧化酶?2(COX?2)抑制剂塞来昔布(Celecoxib)联合化疗药物顺铂(DDP)或联合X射线对A549人肺腺癌细胞增殖的影响及可能机制。 方法 应用MTS法分别检测Celecoxib与DDP联用对A549细胞增殖的影响及联合X射线对A549细胞存活分数(SF)的影响，流式细胞术检测细胞凋亡。 结果 在一定浓度范围内，Celecoxib和DDP均可抑制A549人肺腺癌细胞的生长，其抑制作用呈量?效关系。两者联用可增强对A549细胞生长的抑制作用，DDP浓度≥1mg/L时两者具有协同或相加作用。Celecoxib与X射线联用可显著降低细胞存活分数(SF)，增加细胞凋亡率。 结论 Celecoxib与DDP联合可增强对A549人肺腺癌细胞的生长抑制效应；Celecoxib与X射线联合时，可增加A549人肺腺癌细胞的凋亡率，增强其对放射的敏感性。

【关键词】  肺癌;环氧化酶2;体外实验;凋亡;X射线

基金项目：江西省科技厅基金课题资助

　　The Depressive Effect of Detected on the Proliferation of A549 Human Lung Adenocarcinoma Cell Lines and Celecoxib  Combined with Cisplatin or X?ray

　　　Abstract：Objective   This study is designed to observe the depressive effect of celecoxib combined with cisplatin or X ray on A549 human lung adenocarcinoma cells.Methods  The depressive effect on the proliferation of A549 cells was detected by MTS technique when celecoxib was conbined with cisplatin,the effect on SF of A549 cells was detected by MTS technique when celecoxib was combined with X ray,the apoptosis of A549 cells was detected by flow cytometry.Results  Within a certain concentration,celecoxib and cisplatin was able to inhibit the proliferation of A549 cells respectively,and dose?effect relationship was detected in the process.The combination of celecoxib (0.35mg/L) and cisplatin could enhance the depressive effect,and synergistic effect or addition effect was detected in the combination when the concentration of cisplatin was more than 1mg/L.In addition,celecoxib/X ray(4Gy) combination significantly decreased the SF of A549 cells and increased the apoptosis rate of A549 cells.Conclusion  Celecoxib/cisplatin combination could enhance the depressive effect on the proliferation of A549 human lung adenocarcinoma cells; Celecoxib/X ray could increase the apoptosis rate of A549 human lung adenocarcinoma cells,enhance the cells' radio sensitivity.

　　Key words：Lung Cancer;COX?2 inhibitor;In vivo experiment;Apoptosis;X?ray

　　0  引言

    目前，国外已经有预临床实验证实了选择性COX?2抑制剂可提高一些化疗药物的细胞毒活性[5]，还可增加肿瘤细胞对放疗的敏感性[6]。本课题借鉴国内外有关研究，在观察COX?2抑制剂Celecoxib与DDP联合对A549细胞抑制作用的基础上，进一步观察其与X射线联合对A549细胞的影响，从而为肺癌的临床提供基础研究资料。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞株与细胞培养 

　　人肺腺癌细胞株A549购自院上海细胞生物学研究所，用含体积分数为10％的胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、95%湿度CO2培养箱进行培养。待细胞呈对数生长，即用0.25%的胰蛋白酶溶液消化，分瓶并扩大培养。

　　1.1.2主要试剂及仪器 

　　Celecoxib(昆山化工医药原料有限公司)，化学结构式为C17H14F3N3O2S，25℃溶于二甲亚砜(DMSO)；DDP(云南个旧生物药业有限公司)。其他主要试剂仪器包括MTS/PMS(Promega)、酶联免疫检测仪、流式细胞仪和直线加速器(瑞典依科达公司)。

　　1.1.3药物浓度参照其常用剂量在人体达到的血浆峰浓度，选择其血浆峰浓度的1/4～1/10倍范围，顺铂血浆峰浓度为2mg/L，Celecoxib血浆峰浓度为0.7mg/L。

　　1.2方法

　　1.2.1Celecoxib与DDP联合对A549细胞的影响 

　　MTS法检测细胞生长抑制。取96孔无菌培养板一个，每孔加入含有2×105/ml肿瘤细胞的DMEM细胞悬液100μl。设空白组(只含等量溶剂)、Celecoxib组、顺铂组及联合组，每组3复孔，于37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养6h。肿瘤细胞完全贴壁后，实验组中分别加入不同浓度的干预药物，使DDP终浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0和8.0mg/L；Celecoxib终浓度分别为0.175、0.35、0.7、1.4和2.8mg/L；联合组Celecoxib浓度为0.35mg/L。继续培养48h后，每孔加入MTS/ PMS混合液20μl培养2h，应用酶标仪,于492nm波长处测光吸收(OD)值。根据公式细胞生长抑制率(E)：E=1－实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。按下式计算Q值并判断两药的联合效应[7]：Q = E(A+B)/[EA+(1－EA)×EB]，其中，E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率。Q为0.85～1.15表示两药作用相加，Q＞1.15表示两药作用协同，Q＜0.85表示两药作用相互拮抗。上述实验重复3次。

　　1.2.2 Celecoxib与X射线联合对A549细胞的影响

　　1.2.2.1 X线照射条件 

　　细胞在室温下，直线加速器6MV?X线、SSD照射，加2cm标准等效填充物(2cm厚有机玻璃板)，平均剂量率200cGy/min。

　　1.2.2.2 MTS法检测存活分数 

　　取24孔培养板一个，设4Gy照射组及4Gy＋Celecoxib联合组，每组3复孔，按上述接种方法，每孔加入含有2×105/ml肿瘤细胞的DMEM细胞悬液100μl及DMEM完全培养基400μl；另取24孔培养板一个，设空白对照组3复孔，每孔加入细胞悬液100μl及DMEM完全培养基400μl，于37℃、5% CO2，饱和湿度条件下培养6h。空白对照组加入DMEM完全培养基500μl，联合组经不同浓度Celecoxib 500μl处理，1h后经X线照射，继续培养5d， MTS法检测OD值，按下式计算存活分数（SF）：SF＝实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。

　　1.2.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 

　　取对数生长期的A549细胞1×106/ml接种于培养瓶中，24h后换液。分为单纯照射组和Celecoxib处理组,均重复3瓶。单纯照射组不加药物，Celecoxib处理组终浓度为0.35mg/L，于照射前1h加入，分别照射0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy,继续培养24h。将样品制备成单细胞悬液,固定于70%乙醇,-20℃保存,上机测试前去除固定液,使样品细胞悬浮于缓冲液中,调整细胞浓度在105/ml左右。加入溴化乙啶染液1.0ml(含溴化乙啶10μg/ml,RNA酶10μg/ml,Triton?X?100 1.0%),4℃染色30min后,上机测试,分析计算凋亡率。

　　1.3统计学方法
 
    计量资料用±s表示，各组间差异采用SPSS11.5统计软件行单因素方差分析，相关性采用Pearson相关分析，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有显著性。

　　2结果
　
　　2.1Celecoxib、DDP以及两者联用对A549细胞的生长抑制效应 

    不同浓度Celecoxib对A549细胞的生长抑制率分别为4.13%、13.66%、22.73%、29.28%及41.56%，在一定浓度范围内呈量?效关系(r＝0.996，P<0.01)。Celecoxib单用时，浓度为0.35mg/L可显著抑制A549细胞的增殖，因此，根据Celecoxib对A549细胞的抑制效应结果，选用0.35mg/L作为与DDP联合用药的干预浓度，见表1。表1DDP、DDP+Celecoxib对A549细胞生长抑制效应(略)

    由表1可见，当DDP单用时，浓度为2.0mg/L可显著抑制A549细胞的增殖，随着DDP浓度的增加，抑制作用增大，呈量?效关系(r=0.980，P=0.003)。而联合组DDP浓度为1mg/L时即可显著抑制A549细胞的增殖，随浓度增加对A549细胞增殖的抑制率也显著增加(P<0.001)。经Q值，当DDP浓度为0.5mg/L时，与Celecoxib联用无相加或协同作用(Q=0.41)；DDP浓度≥1.0mg/L时，与Celecoxib联用有相加/协同作用。

　　2.2Celecoxib联合X射线对A549细胞的生长抑制效应

　　2.2.1与4Gy单纯照射组相比较，除4Gy+0.175mg/L组外，其余各组细胞的存活分数均有显著降低，且随着Celecoxib浓度加大，细胞存活分数降低(r=-0.988，P=0.001),见表2。表2  Celecoxib与X射线联合对A549细胞的存活分数影响的比较(略)        

　　2.2.2  流式细胞术的结果显示，随着照射剂量的增加，A549细胞的凋亡率增加，联合组的细胞凋亡率明显高于单纯X线照射组(P均<0.05)，见表3。表3  Celecoxib与X射线联合对A549细胞的凋亡率影响的比较(略)

　　3讨论

    动物实验已经证实[8,9]，COX?2抑制剂可以抑制肺癌的发生、，促进肺癌细胞的凋亡。

    本研究发现，COX?2抑制剂Celecoxib可抑制A549肺癌细胞的增殖，在一定浓度范围内随浓度增加其抑制作用增强，呈量?效关系；DDP单用时其对细胞的抑制作用也同样呈现量?效关系，浓度为2mg/L可显著抑制A549细胞增殖，而当两者联合时，DDP浓度为1mg/L即可显著抑制细胞增殖,这一结果表明两者联用时增加了对细胞的抑制作用，而对于低浓度DDP，联合Celecoxib时虽然对细胞的抑制率有一定程度的增加，但是无显著差别，而且较Celecoxib 0.35mg/L单用时反而有所降低；进一步分析两药的联合效应发现：DDP浓度为≥1mg/L时，两者联合具有协同/相加作用；而DDP浓度为0.5mg/L时，两药具有拮抗作用(Q=0.41)，这一结果可能是引起上述抑制率较Celecoxib单用时有所降低的原因。DDP是一种铂类化合物，可与DNA形成链内或链间交叉连接从而杀伤肿瘤细胞，还可诱导细胞凋亡[10]。因此，推测Celecoxib与DDP的协同/相加作用可能是通过增强对细胞增殖的抑制和对凋亡的诱导来实现的，具体的机制尚需其他实验研究探讨。

    放射是恶性肿瘤综合治疗的重要方法之一，肿瘤细胞的放射敏感性与放疗效果密切相关，研究指出[11]，凋亡可明显增加放疗效果。既往研究[12]表明COX?2抑制剂可促进肿瘤细胞凋亡，因而理论上可增加肿瘤细胞对放射的敏感性。实验结果显示,与单纯照射组相比较，联合组Celecoxib浓度≥0.35mg/L时，随着浓度增大细胞SF显著下降，而浓度为0.175mg/L时，SF并无明显改变，可能与浓度较低不足以对细胞造成明显影响所致；不同剂量的X线照射细胞后，细胞的凋亡率随照射剂量增加而增加，联合组显著高于单纯照射组，因此，提示Celecoxib对A549细胞有放射增敏作用，而这一作用似乎是通过促进细胞凋亡实现的。          
 
    关于Celecoxib能增加A549人肺腺癌细胞对放射的敏感性的研究在国内尚未见报导。但是，本实验并未进一步研究Celecoxib是通过何种途径来促进细胞凋亡的，另外，本实验采用的研究方法为体外细胞抑制实验，肿瘤细胞处于脱离了体内生长的内环境的情况下，因而必然会受到外界多种不确定因素的影响，故本实验结果并不能表明Celecoxib与DDP或X射线联合应用在体内实验或临床上是否也能获得同样的效果，同时，Celecoxib的最佳剂量、毒副反应等也尚有待于动物实验以及临床实验进一步研究证实。

【】
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