肺癌中PTEN基因表达及其与凋亡的关系

【关键词】  小细胞肺癌；,,PTEN；,,凋亡；,,免疫组织化学技术；,,TUNEL,,,,

　　摘要：  目的： 探讨非小细胞肺癌组织中PTEN 的表达及临床意义与细胞凋亡的关系。方法： 72例肺癌组织(NSGLG和SCLC)、16例癌旁正常肺组织和7例肺良性病变组织PTEN 的表达采用免疫组织化学SP 法检测，34例SCLC 组织肿瘤细胞凋亡采用TUNEL法检测。结果：PTEN基因在肺癌组织中的阳性表达率为54.16%，显著低于肺良性病变组织的93.75% (P<0.01)。小细胞癌组织中的阳性率为31.8%，显著低于鳞癌组织(62.96%)和腺癌组织(50.00%) (P<0.05)。结论：PTEN基因的缺失与肺癌的发生与密切相关，并可能影响肿瘤的分化和癌细胞凋亡。

　　关键词：  小细胞肺癌；  PTEN；  凋亡；  免疫组织化学技术；  TUNEL   

　　PTEN基因是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，它在调控细胞生长及细胞凋亡过程中起着重要作用。PTEN 基因的失活与多种肿瘤的发生发展密切相关。本研究初步探讨PTEN 在肺癌发病机制中的作用及PTEN 蛋白的缺失与非小细胞肺癌癌细胞凋亡的关系。

　　1  材料和方法

　　11  材料

　　收集我院手术切除后并经病理证实72 例肺癌组织标本，术前均未接受化疗和放疗。其中男51例，女21例；年龄34 ～ 80岁，平均年龄58岁。根据WHO《肺肿瘤组织学分型》标准分类，其中鳞癌27 例，腺癌32 例。高分化11 例，中分化22 例，低分化26 例。小细胞癌症22例。另取16 例肺癌病灶旁肺组织及7 例肺良性病变组织作对照。所有组织均经10% 的中性甲醛固定，石蜡包埋，3 μm 厚石蜡切片。

　　12  免疫组织化学方法

　　PTEN为鼠抗人浓缩型单克隆抗体（1:100），PI3K为兔抗人浓缩型多克隆抗体（1:100），通用型SP试剂盒，均购自北京中山生物技术有限公司。采用SP法，DAB显色，苏木素复染，并镜检分析结果。空白对照用PBS取代一抗，其余步骤不变。

　　13  原位凋亡细胞检测

　　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记法（ TUNEL），石蜡切片脱蜡水化、经组织处理液处理、蛋白酶K 消化、过氧化氢孵育、加平衡液和TdT 反应工作液、终止液终止反应后加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，DAB 显色、苏木精衬染，树脂封片。凋亡试剂盒购自Roche 公司和Intergen 公司。所有操作均按说明书进行。

　　14  结果判断标准PTEN

　　结果判断以细胞质中出现棕黄色且高于背景无特异染色为阳性细胞，阳性细胞百分率，< 10%为“ - ”，10% ～ 30%为“ + ”，30% ～ 70%为“ + + ”，70% ～ 100%为“ + + + ”。凋亡细胞结果判断以细胞核染成棕褐色为凋亡细胞，每一标本随机选取4 个400 倍视野，每一视野连续记数100 个癌细胞，计算癌细胞凋亡指数。

　　15  统计学分析方法

　　所有数据均用SPSS11.5软件包进行统计学分析，所得PTEN阳性表达率用卡方检验和Fisher检验。P<0.05时被认为有统计学意义。

　　2  结果

　　21  PTEN 蛋白在肺癌组织、癌旁肺组织及肺良性病变组织中的表达

　　PTEN 蛋白在肺癌组织阳性表达为粗、细不一的棕黄色颗粒，主要位于肿瘤细胞胞浆中，细胞核中也有少量表达。72 例肺癌组织中PTEN 蛋白阳性表达率为54.16%（39 / 72）。PTEN 蛋白在癌旁肺组织及肺良性病变组织阳性表达为粗、细不一的棕黄色颗粒，主要着色于支气管粘膜上皮细胞及粘液腺及肺泡上皮细胞中。PTEN 蛋白在癌旁肺组织阳性表达率为93.75%（15/ 16），在肺良性病变组织阳性表达率为100%（7 / 7），肺癌组织中PTEN 蛋白阳性表达率显著低于癌旁肺组织及肺良性病变组织。见表1。

　　表1  肺癌与癌旁肺组织、肺良性病变组织间PTEN 蛋白阳性表达率比较（略）

　　注：肺癌与癌旁肺组织比较，P<0.05，与肺良性病变组比较，P<0.01。

　　22  PTEN 蛋白在非小细胞肺癌与小细胞肺癌中的表达

　　在NSCLC 中，PTEN 蛋白阳性表达率为55.93%（33 / 59），其中，鳞状细胞癌阳性表达率为62.96%（17 / 27），腺癌阳性表达率为50%（16/ 32），两者比较差异无显著性（P>0.05）。在SCLC 中，PTEN 蛋白阳性表达率为31.38%（7/ 22），PTEN 蛋白在非小细胞肺癌与小细胞肺癌中的阳性表达率比较差异有显著性（P< 0. 05）。见表2。

　　表2  非小细胞肺癌与小细胞肺癌PTEN蛋白阳性表达率比较（略）

　　23  42例SCLC 组织细胞凋亡的结果

　　凋亡的癌细胞阳性染色为细胞核染成棕褐色，31 例PTEN 阴性染色SCLC 标本癌细胞凋亡指数为（6.12±3.36）%，11 例阳性染色癌细胞凋亡指数为（3.57±3.95）%，两者相比有显著性差异（P<0.05）。

　　3  讨论

　　PTEN是1997年首先被发现的具有磷酸醋酶活性的抑癌基因，它含有1209个核昔酸，编码由403个氨基酸组成，分子量为47000，是位于细胞质中的蛋白质，即酪氨酸磷酸酶蛋白［1］。它所编码的磷酸醋酶通过阻断磷醋酞肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，使局灶性粘着斑激酶去磷酸化，下调Ras介导的丝裂酶原激活蛋白激酶活化而对细胞的周期调控有影响，并对细胞增殖、浸润和迁移等多方面起调控作用［2］。因此，PTEN基因的缺失、突变或表达产物的失活，可影响肿瘤的发生和。据报道，在脑胶质母细胞瘤、前列腺癌、乳癌及子宫内膜癌等均发现PTEN基因的杂合性丢失。有文献报道，在子宫内膜癌中PTEN的突变率大约50％［3，4］。这是迄今发现的所有癌中PTEN突变率最高的一种肿瘤，突变主要集中在5,7和8号外显子，进一步支持了PTEN活性的改变与多种类型肿瘤的发生有关的观点。文献报道，肺癌中也存在PTEN突变和杂合性丢失。Kim等［5］报道42%~70%的小细胞肺癌和 27%~50%的非小细胞肺癌有10q上PTEN的杂合性丢失。Kohno等［6］检测了40株肺癌细胞系 ，15株小细胞肺癌中6株有PTEN DNA纯合性丢失 ，2株有错义突变和无意义突变，小细胞肺癌的PTEN丢失似乎高于非小细胞肺癌。

　　本研究结果显示,PTEN基因在肺良性病变中的阳性率显著高于肺癌组织(P<0.01)。因此，PTEN基因可能参与了肺癌的发生，它的缺失可能使肺上皮获得生长和浸润优势，从而形成肿瘤。在肺癌组织中，肺小细胞癌中PTEN基因的阳性表达率显著低于其他类型(P<0.05)，说明PTEN基因在肺小细胞癌的发生、发展中起一定作用。在不同分化程度的肺癌组织中，PTEN基因的表达同样有差异，无论高分化鳞癌与低分化鳞癌之间，还是高分化腺癌与低分化腺癌之间，其阳性表达率均有显著差异(P<0.05)，提示PTEN基因的缺失在肿瘤的分化和演变过程中也起一定作用。

　　细胞凋亡是新陈代谢过程中调节细胞数和生命活动的重要环节，凋亡受阻将导致细胞代谢的紊乱及肿瘤的发生发展。据目前研究报到，如Stambolic等［7］在PTEN 缺陷的细胞株中导入外源性PTEN，发现外源性PTEN 的表达能够恢复细胞对凋亡刺激产生正常的凋亡，对PTEN - / - 的永生化小鼠胚胎纤维细胞瘤细胞株与PTEN + / - 细胞株同时使用紫外线、TNFα、热休克蛋白、放线菌酮等凋亡刺激发现PTEN - / - 细胞系成活时间更长，对凋亡的敏感性下降。Li 等［8］在乳腺癌细胞系表达PTEN 后，发生诱导性凋亡。因此，认为PTEN 蛋白有诱导细胞凋亡的作用。本组结果显示，31 例PTEN 阴性染色SCLC 标本癌细胞凋亡指数（6.12±3.36）%，11 例阳性染色癌细胞凋亡指数（3.57±3.95）%，两者相比有显著性差异（P<0.05），提示PTEN 蛋白与癌细胞凋亡有关。我们的结果与细胞株中的结果一致。研究表明，PTEN与细胞凋亡之间在调控机理上与途经上可能存在某些关联性，具体调控机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。

　　文献

　　1  PennisiE .N ewt umorsu ppressorfo undtwice. S c ience,1997，275 (3 ) :1876~1878.

　　2  张蕾，刘彤华.PTEN第一个具有磷酸醋酶活性的抑癌蛋白国外医学・分子生物学分册，2000,22(3):2 57~260

　　3  Bernard T, Jacques B, et al. Cathepsin D expression by cancer and stromal cells in breast cancer: an immunohistochemical study of 1348 cases. Br Cancer Res Trea，1999, 55; 137.

　　4  Anitha J, George T. The role of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis and tumor metastasis. Pathol Oncol Res，2001，7(1):14.

　　5  SingerC F,K ronsteinerN ,M arton E, et al. MMP2 and MMP9 expression in breast cancerderived human fibroblasts isd ifferentiallyr egulatedb ys tromalepithelialin teractions.Breast Cancer Res Treat，2002, 72(1):69.

　　6  Bergers G, Brekken R, McMahon G, et al. Matrix metalloproteinase9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nature Cell Biol, 2000, 10：737.

　　7  Stambolic V, Suzuki A, et al. Negative regulationof PKB/ Akt dependent cell survival by the tumor suppressorPTEN. Cell，1998，95（1）：29~39.

　　8  Li J，Simpson L，Takahashi M，et al . The PTEN/MMAC1 tumorsuppressor induces cell death that is rescued by the AKT / protein kinaseB oncogene. Cancer Res，1998，58（29）：5667~5672.