维生素A酸对小鼠囊胚TGF

【关键词】  全反式维生素A酸；,,转化生长因子

　　摘要：  目的：探讨TGFβ1细胞因子对着床前胚胎发育的作用，从而探讨ATRA对着床前期胚胎发育毒性作用，为其致畸机理提供实验依据。方法： 通过促超排卵，获取妊娠3.5d小鼠囊胚，随机分成三组，即对照组（空白）、实验1组（含1μmol/L的ATRA）和实验2组（含10μmol/L的ATRA）， 分别培养在含0、1μmol/L 和10μmol/L的ATRA的M199培养基中，培养24h，然后再吸出囊胚。用免疫组织化学SP法，分别检测不同剂量组ATRA对小鼠囊胚TGF―β1蛋白表达的状况，利用HPIAS2000图像分析系统测定TGFβ1蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： TGFβ1蛋白在囊胚细胞中的表达，实验1组与对照组囊胚TGFβ1蛋白表达的阳性面积率及平均光密度有显著性差异（P<0.01）；实验2组与空白组和实验1组相比均存在显著性差异（P<0.01）。结论：细胞因子TGFβ1在胚胎发育的调节中发挥了重要作用。

　　关键词：  全反式维生素A酸；  转化生长因子β1（TGFβ1）；  囊胚；  小鼠   

　　维生素A酸（Retinoic acid,RA）即视黄酸，是维生素A即视黄醇(retinal，ROL)在体内氧化代谢的一类具有生物活性的产物。此外，维生素A酸在临床上也是用来痤疮和其他许多皮肤病的重要药物。同时它也是用于一些恶性肿瘤联合治疗的药物之一，如卵巢癌、乳腺癌、白血病及肺癌等。但维生素A酸也是公认的致畸因子，许多动物实验已经证实在妊娠期间服用维生素A酸对胎儿的发育可产生重要的影响。RA对囊胚的这种致畸效应可能由于其诱导ICM和ＴＥ细胞过渡凋亡所致。而RA诱导囊胚细胞凋亡目前尚未见报道。本研究通过免疫组织化学方法研究TGFβ1蛋白在囊胚细胞中的表达。

　　1  材料与方法

　　11  材料

　　111  试验动物  一级健康昆明种小白鼠（SPF级），由武汉大学医学院动物试验中心提供。

　　112  主要试剂和仪器  孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）为天津生物制品厂产品；ATRA购自上海第六制药厂；propodium iodide(PI)和bisbenzimide(Hoechst 33258)以及Triton100均系美国Sigma公司产品；M199培养基为美国Hyclone公司的产品；浓缩型兔抗人TGFβ1多克隆抗体DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸均购自北京中山技术公司；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒系福州迈新公司产品。

　　12  方法

　　121  小鼠囊胚的获取

　　选用本校动物中心提供的一级健康昆明种小白鼠,雌雄各40只，体重(30±5)g，光照、黑暗各12h，自由摄食、饮水。于雌鼠腹腔注射10U PMSG，48h后再腹腔注射10UHCG促超排卵,当晚与雄鼠1:1合笼。次日晨检查阴栓，见阴栓者记妊娠0天。于妊娠3.5d时，将孕鼠脱臼处死，放入75％酒精中浸泡消毒约5min，于超净工作台上取出子宫，由阴道端插入7号针头注入M199培养基，冲出囊胚，一侧子宫可获取约10~20个。将所有的囊胚冲入凹皿中，并用PBS洗涤囊胚5min×3次。所有操作均在解剖显微镜下进行。

　　122  胚胎培养

　　将所有囊胚随机的分为3组，即对照组（空白）、实验1组（含1μmol/L的ATRA）和实验2组（含10μmol/L的ATRA）。将囊胚培养在35mmFalcon塑料培养皿中，每皿加入1ml培养基，含有20个囊胚，实验1组中加入1μmol/L 的ATRA，实验2组中加入10μmol/L的ATRA，所有ATRA均溶于0.02%的DMSO。对照组只加等量的0.02%的DMSO。每组培养基均加入0.3%BSA，1 mmol/L 谷氨酰胺，并置入37℃，5% CO2 培养箱内培养24h。所有操作均在解剖显微镜下进行。

　　13   免疫组织化学SP法检测TGFβ1相关抗原

　　在解剖显微镜下，用毛细管吸出囊胚，并用PBS洗涤5min×3次，随后立即固定于4%多聚甲醛30 min，再用PBS洗涤5min×3次，最后转到涂有多聚赖氨酸的玻片上，干燥24h待用。免疫组化SP法主要步骤：

　　① 将载有囊胚的玻片用蒸馏水洗涤5min×3次；

　　②1% trironX100作用10 min，增加抗体的穿透性，蒸馏水洗涤5min×3次；

　　③ 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，蒸馏水和PBS各洗4×5min；

　　④ 正常羊血清37℃孵育35min以减少非特异性反应，甩干；

　　⑤ 一抗（TGFβ1，1:100；)37℃孵育1 h，4℃过夜。第二天于37℃下复温1h，PBS洗4×5min；

　　⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育40 min，PBS洗4×5min；

　　⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育40 min，PBS洗4×5min；

　　⑧ DAB双氧水显色10min，自来水冲洗终止反应；

　　⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

　　阴性对照用PBS代替一抗，其余同上。

　　14  结果判断

　　141  TGFβ1相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。

　　142  利用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对TGFβ1的表达进行定量分析，每张标本随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　15  统计学处理

　　对各组结果作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果

　　21  TGFβ1蛋白表达结果

　　TGFβ1蛋白免疫反应阳性细胞呈棕黄色，阳性物质分布囊胚所有细胞的细胞浆，细胞核呈蓝色，并根据棕黄色颗粒分布的密度和着色深浅分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性4级。本实验发现在对照组，囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒，呈弱阳性着色，TGFβ1蛋白表达呈弱阳性；在实验1组中，囊胚细胞胞浆中可见较多棕黄色颗粒，且均匀分布， TGFβ1蛋白在实验1组囊胚细胞中表达呈阳性；实验2组中囊胚细胞胞浆中可见很多均匀分布的棕黄色颗粒，TGFβ1蛋白呈强阳性表达。图像分析结果显示，试验1组囊胚细胞TGFβ1蛋白表达的平均光密度为0.1203，试验2组囊胚细胞TGFβ1蛋白表达的平均光密度为0.1924，对照组囊胚TGFβ1蛋白表达的平均光密度为0.0796； 试验1组囊胚细胞TGFβ1蛋白表达的阳性面积率为0.1453，试验2组囊胚细胞TGFβ1蛋白表达的阳性面积率为0.2167， 对照组囊胚TGFβ1蛋白表达的阳性面积率为0.0752。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，对照组与实验1组囊胚TGFβ1蛋白表达的阳性面积率及平均光密度有显著性差异（P<0.01）；实验2组与对照组和实验1组相比均存在显著性差异（P<0.01）。见表1。

　　表1  不同浓度ATRA对小鼠囊胚TGFβ1蛋白表达的影响（略）

　　3  讨论

　　许多动物实验已经证实在妊娠期服用维生素A酸对胎儿的发育可产生重要的影响。如在小鼠怀孕后7或8天服用维生素A酸（12mg/kg）可导致胚胎发育延迟，颅神经盘异常分化及后脑发育异常。在小鼠怀孕第9天服用维生素A酸（20/kg）会导致小鼠胚胎内耳形态畸形。在小鼠怀孕第10天到第16天服用维生素A酸（120mg/kg）可导致胚胎肢体畸形和神经发育异常［1~3］。国外学者研究发现，体外培养的小鼠囊胚用过量的RA出理后，会导致胚胎生长发育迟缓而着床失败或着床后胚胎死亡。RA对囊胚的这种致畸效应可能由于能诱导ICM和ＴＥ细胞过渡凋亡。近年来，随着妊娠早期流产率增加及已知流产儿中染色体畸变率增高，有关着床期和着床前期发育毒性也越来越受到重视，已成为当前发育毒研究的一个热点。而维生素A酸 (ＲＡ)是近年来研究的比较广泛的一种凋亡诱导剂和致畸因子,用ＲＡ处理的发育胚胎可出现面部、神经管和四肢等部位的多种畸形。这些畸形的发生取决于ＲＡ的给药时间和剂量,相对低剂量的ＲＡ在不同的处理时间对不同的组织类型具有不同的作用,高剂量的ＲＡ会引起胚胎死亡［4，5］。ＲＡ的水平被不同的蛋白质所调控。这些蛋白质和ＲＡ结合,并将其运到相应的组织细胞。早期胚胎中由于缺乏这些蛋白质或者这些蛋白质不足以处理过高水平的ＲＡ时,ＲＡ较易通过胎盘。畸形发生可能是由于ＲＮＡ水平过高而直接作用于细胞迁移、增殖、分化和死亡这些重要过程所致。

　　胚胎发育过程中的胚胎细胞总是在增殖和凋亡之间保持平衡。已经证实维生素A酸诱导细胞凋亡涉及到整个胚胎发育过程中，例如，维生素A酸由于增加凋亡细胞的死亡，而对指（趾）分开起重要作用，这在四肢发育中可以观察到。国外有资料显示在接受维生素A酸处理的滋养层干细胞其生长增殖能力是下降的［6］。用人的滋养层细胞进行的体外试验证实，类维生素A酸能刺激HCG的分泌和滋养层细胞的分化。维生素A酸诱导胚胎发育过程中细胞凋亡的机制，越来越被人们所认识。

　　死亡是生命的。这适用于整个机体,也适用于单个细胞。细胞死亡是生命现象中不可逆转的终止,是一个普遍的现象。既发生于正常的胚胎发育中,也发生于成体组织。根据细胞死亡的形态学、生物化学和生理学特征的不同,可将细胞死亡分为两大类:细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(programmed cell death  PCD)［7，8］。尽管PCD对是否与细胞凋亡等同仍有不同的看法,但由于大多数PCD呈现细胞凋亡的形态特征,而且在致畸物诱发胚胎异常发育中通常表现为细胞凋亡的形态特征,故本研究均用细胞凋亡表示。近几年研究表明,细胞凋亡这种死亡的新模式既是胚胎正常发育中的重要事件,又是致畸因素导致胚胎异常发育的重要形式。因此,细胞凋亡的研究有助于胚胎正常和异常发育机制的阐明。

　　转化生长因子β1 (TGFβ1)是转化生长因子家族中的一个重要成员,其分子量为25KD。它具有多种生物学功能，特别是调节细胞的生长和分化，参与细胞外基质蛋白的合成与降解，对细胞乃至整个机体的生命活动具有广泛而重要的生理意义。TGFβ1在正常或肿瘤细胞中都普遍表达［9，10］。通常情况下，TGFβ1对间质来源的细胞生长有促进作用，而对上皮细胞主要是一种负性生长调控作用。TGFβ1作为一重要的细胞生长、分化调节因子，它能够干扰多种以酪氨酸激酶为受体的致分裂剂的作用，其中包括PDGF 、EGF 、IGFⅠ等，而这些因子均是早期胚胎发育与植入的重要调节因子。因此，TGFβ1可能对胚胎发育以及胚胎母体相互作用起到广泛性的调节作用。

　　本实验研究发现，在对照组，囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒，呈弱阳性着色，TGFβ1蛋白表达呈弱阳性；在实验1组中，囊胚细胞胞浆中可见较多棕黄色颗粒，且均匀分布， TGFβ1蛋白在实验1组囊胚细胞中表达呈阳性；实验2组中囊胚细胞胞浆中可见很多均匀分布的棕黄色颗粒，TGFβ1蛋白也呈强阳性表达。并且对于囊胚TGFβ1蛋白表达的平均光密度及阳性面积率，对照组与实验1组相比具有显著性差异（P<0.01）；实验2组与空白组和实验1组相比均存在显著性差异（P<0.01）。且ATRA剂量越大TGFβ1蛋白表达越强。同时还发现实验组囊胚内细胞团发生皱缩，细胞数目减少。证实了TGFβ1参与了早胚生长发育过程中，细胞发生增殖或死亡的调节。但ATRA导致早期胚胎死亡和着床失败的原因和机制还不完全清楚，对小鼠胚胎致畸作用的具体机制以及TGFβ1对小鼠胚胎生长发育作用机理还有待进一步探讨。    

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　　2  Hu Jenhuang,MD;YaLing,BS. Effects of Retinoic Acid on Preimplantation Embryo Development in Mice .Human Reproduction,2001,681~687.

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　　5  G.A.Thouas,N.A.Korfiatis,A.J.French.Simplified technique for differential  staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine boastocysts　Reproductive  BioMedicine Online,2001,25~29

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　　10  Giudice L C. Genes associated with embryonic attachment and implantation and the role of progesterone. J. Reproductive Med, 1999,44:165~171.