抑癌基因PTEN在上皮性卵巢癌中的表达及其与VEGF表达的关系

                  作者：徐京晶 朱润庆 李铭 赵恒敏

【关键词】  卵巢癌；,,免疫组织化学；,,PTEN,,,,

　　摘要：  为探讨抑癌基因PTEN表达在卵巢癌发生和演进中的作用及其与VEGF的相互关系，对8例正常上皮来源的卵巢组织、18例卵巢交界性肿瘤、60例上皮性卵巢癌石蜡切片组织，应用免疫组织化学SP法、LSAB法检测PTEN蛋白、VEGF蛋白的表达。结果显示，PTEN在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的阳性表达率分别为87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的阳性表达率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)；I/II期阳性表达率37.50% 明显高于III/IV期的13.89%（P<0.05）；卵巢内膜样癌PTEN阳性表达率7.14%，显著低于浆液样34.78%或黏液样囊腺癌44.44%（P<0.05）。PTEN表达与VEGF表达呈负相关（P<0.01）。

　　关键词：  卵巢癌；  免疫组织化学；  PTEN   

　　人体多种肿瘤中已发现PTEN基因的突变，野生型PTEN通过PI3K/PIP3/Akt通路抑制细胞增殖，促进其凋亡；通过MAPK通路影响细胞生长；通过FAK通路阻断细胞的局部粘附与迁移。PTEN作为抑癌基因，在细胞凋亡和肿瘤演进中发挥作用。血管内皮生长因子VEGF与其特异性受体VEGFR结合，在肿瘤演进过程中发挥促进血管生成和提高血管通透性的生物学效应。我们应用免疫组化技术检测正常卵巢、卵巢交界性肿瘤和上皮性卵巢癌中PTEN和VEGF的表达，探讨其在卵巢癌发生及演进中的相互作用。

　　1  材料与方法

　　11  标本来源

　　研究标本86例取自武汉市第八1999年至2005年病理存档的石蜡标本，所有手术患者术前均未接受过放疗、化疗或激素，诊断均经常规病理切片证实。年龄32~65岁，中位年龄48岁。正常上皮来源的卵巢组织8例，卵巢交界性肿瘤18例，上皮性卵巢癌60例（其中浆液性囊腺癌23例，黏液性囊腺癌9例，卵巢内膜样癌28例；高~中分化卵巢癌25例，中~低分化卵巢癌35例；按FIGO分级，I/II期24例，III/IV期36例；卵巢癌伴淋巴结转移15例，无淋巴结转移45例）。

　　12  实验试剂

　　鼠抗人PTEN单克隆抗体、鼠抗VEGF单克隆抗体、 SP试剂盒、LSAB试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

　　13  方法

　　石蜡块标本制成4μm厚的切片，免疫组织化学染色程序按SP试剂盒及LSAB试剂盒说明进行，PBS代替一抗作阴性对照，已知乳腺癌阳性片作阳性对照。PTEN阳性表达为淡黄色至棕褐色物质，定位于细胞浆，高倍镜下每张切片选5个视野，每个视野记数100个细胞。(-)：<25% ; (+)：>25%。VEGF阳性表达为棕色或棕褐色细胞，高倍镜下观察染色阳性细胞数，连续观察5个视野取其平均数。（-）：0；（+）：1；（++）：2；（+++）：3。

　　14  统计学处理

　　所有数据采用CS2000软件包分析，根据适用条件以Pearson未校正法或Yates校正法χ2值, 或直接用确切概率法计算P值。PTEN与VEGF的表达关系采用配对四格表的相关分析Yates校正法。

　　2  结果

　　21  PTEN、VEGF在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的表达

　　PTEN在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的阳性表达率分别为 87.50%（7/8）、50.00%（9/18）、23.33%（14/60），PTEN的阳性表达率在上皮性卵巢癌中低于正常卵巢、卵巢交界性肿瘤，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。

　　VEGF在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤、上皮性卵巢癌中的阳性表达率分别为12.50%（1/8）、38.89%（7/18）、81.67%（49/60），VEGF的阳性表达率在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤与上皮性卵巢癌中逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　22  PTEN、VEGF表达与卵巢癌临床病理分期的关系

　　PTEN表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关（P<0.05），I/II期阳性表达率高于III/IV期，差异有显著性。在卵巢癌的组织类型中，卵巢内膜样癌PTEN表达最低，显著低于浆液样或黏液样囊腺癌（P<0.05），PTEN表达与卵巢癌的分化程度及有无淋巴结转移无明显相关（P>0.05）。

　　VEGF表达与卵巢癌的临床病理分期呈正相关（P<0.05），I/II期阳性表达率低于III/IV期，差异有显著性。VEGF表达与卵巢癌的分化程度成正相关（P<0.05），高~中分化表达率低于中~低分化（P<0.05）。VEGF表达与卵巢癌的组织类型有无淋巴结转移无明显相关（P>0.05）。

　　23  卵巢癌组织PTEN表达与VEGF表达的关系

　　VEGF表达阳性的卵巢组织中，PTEN的表达率为14.29%（7/49）；VEGF表达阴性的卵巢组织中，PTEN的表达率为63.64%（7/11）。两者的表达呈负相关（P=0.0019<0.01，R=-0.4515）。

　　表1  卵巢癌PTEN、VEGF的表达与临床病理特征（略）

　　表2  卵巢癌PTEN的表达与临床病理特征及与VEGF蛋白表达的关系（略）

　　注：PTEN与VEGF表达呈负相关：R=-0.4515, P=0.0019<0.01 (Yates校正法)。

　　3  讨论

　　PTEN的缺失和突变与多种肿瘤，包括卵巢癌的发生及演进关系密切。PTEN基因定位于染色体10q23.3上［1］，其编码的产物PTNE蛋白是由403个氨基酸组成的一条多肽链［2］，有四个结构域，具有蛋白磷酸酶和脂磷酸酶的双重特异活性。PI3K/Akt/mTOR具有调节细胞凋亡、促进血管形成和肿瘤发育等功能，PTEN蛋白通过对此通路的负性调节抑制细胞增殖及肿瘤形成等。PI3K是细胞内重要的信号传导分子，PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，生成PIP3。Akt是一种Ser/Thr蛋白激酶， PIP3与Akt结合，导致Akt从胞浆转位到质膜，并使Akt的Ser473和Thr308位点磷酸化［3］，促进Bad［4］、mTOR、Caspase3、GSK3等下游底物发挥广泛的生物学效应，促细胞生存等功能。mTOR属于磷酸肌醇激酶3相关激酶家族的一员，是PI3K/Akt的下游底物，可通过改变翻译调节因子4EBP1（真核细胞启动因子4E结合蛋白）和P70S6K的磷酸化状态启动翻译过程［5］。磷酸化的4EBP1可解离释放eIF4E，从而使后者结合于mRNA5'端起始点启动翻译过程。P70S6K磷酸化可通过促使40S核糖体蛋白S6磷酸化而启动翻译。PTEN的磷酸酶活性促使PIP3的3'位点脱磷酸化，抑制依赖PIP3激活的Ser/Thr蛋白激酶活性及翻译调节因子4EBP1等的磷酸化水平，发挥抑癌作用。

　　本研究结果显示，PTEN表达在卵巢癌发生过程中逐渐降低，提示PTEN基因表达在卵巢癌发生中作为早期分子事件发挥重要作用。PTEN表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关，提示PTEN表达下调可能与卵巢癌的演进关系密切。在卵巢癌的组织类型中，卵巢内膜样癌PTEN表达水平显著低于浆液性或黏液性囊腺癌，提示PTEN基因与卵巢内膜样癌的发生和病理生物学行为关系更为密切。

　　在血管形成的诸多刺激因素中，最重要的是VEGF，它在多种肿瘤中高表达。VEGF基因位于6p21.3， VEGF蛋白氨基酸序列高度保守， VEGF与VEGFR特异性结合发挥生物学效应。VEGFR有两种：flt1和KDR，两者均属III类酪氨酸激酶受体家族。KDR和ftl1的功能存在明显差异，KDR对VEGF的亲和力大于ftl1。KDR经VEGF诱导产生酪氨酸自动磷酸化和促有丝分裂活性，引起血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移， KDR主要在血管形成过程中起重要调节作用［6］。VEGF和ftl1结合后其生物学效应主要为调节血管内皮细胞间以及内皮细胞间与基质之间相互作用，表现为明显的腔化作用和增加血管通透性的作用。

　　本研究结果显示，VEGF的阳性表达率在正常卵巢、卵巢交界性肿瘤与上皮性卵巢癌中逐渐增高，提示VEGF在卵巢癌发生中起关键作用。VEGF表达与卵巢癌的临床病理分期呈负相关，提示VEGF表达下调可能与卵巢癌的演进关系密切。

　　本实验证明卵巢癌中PTEN和VEGF的表达呈负相关。已知PTEN蛋白对PI3K/Akt/mTOR通路有负性调节作用，已有研究显示PI3K/Akt/mTOR可能是调控细胞内HIF1表达和活性的一条重要信号途经［7］。许多因素如生长因子、细胞因子、机械刺激等在常氧下也可激活PI3K/Akt/mTOR诱导HIF1α蛋白表达，增加HIF1基因转录活性［8］。HIF1结合于VEGF基因启动子中的的缺氧反应元件HRE，为诱导VEGF表达的重要分子机制，故PTEN基因通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制HIF1α转录因子活性而影响VEGF表达。此外，在KDR经VEGF诱导产生酪氨酸自动磷酸化，引起血管内皮细胞的分裂、增殖过程中，PTEN对抗酪氨酸激酶影响VEGF的信号传导。

　　PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤细胞增殖和生存中具有重要意义，PTEN和VEGF通过此途径相互作用，在肿瘤的形成和演进中发挥了重要作用，对此机制的进一步阐明将会为肿瘤的诊断、预后、提供理论依据。

　　1  Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science, 1997,275:1943~1947.

　　2  Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, et al. Identification of a candidate tumor suppressor gene, MMACI, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers. Nat Genet, 1997, 15(4):356.

　　3  Toker A, Cantley L C, Signalling through the lipid products of phosphoinositide3OH kinase. Nature, 1997, 387(6634):673~676.

　　4  Hirai K, Hayashi T, Chan P H, et al. PI3K inhibition in neonatal rat brain slices during and after hypoxia reduces phosphoAkt and increases cytosolic cytochrome C and apoptosis. Brain Res Mol Brain Res, 2004, 124(1):51~61.

　　5  Nojima H, Tokunaga C, Eguchi S, et al. The mammalian target of rapamycin(mTOR) partner, raptor, binds the mTOR substrates p70 S6 kinase and 4EBP1 through their TOR signaling (TOS) motif. J Biol Chem, 2003, 278(18):15461~15464.

　　6  Shen BQ, Lee DY, Garbar HP, et al. Homologus upregulation of KDR/Flk1 receptor expression by vascular endothelial growth factor in vitro. J Biol Chem, 1998, 273(45):29979.

　　7  B?rdos J I, Chau N M, Ashcroft M, et al. Growth factor mediated induction of HDM2 positively regulates hypoxia inducible factor 1α expression. Mol Cell Biol, 2004, 24(7):2905~2914.

　　8  Zhou J, Schmid T, Frank R, et al. PI3K/Akt is required for heat shock proteins to protect hypoxiainducible factor 1α from pVHLindepent degradation. J Biol Chem, 2004, 279(14):13506~13513.