紫杉醇对涎腺腺样囊性癌实验性肺转移的抑制作用
【摘要】 目的观察紫杉醇对人高转移性涎腺腺样囊性癌细胞(ACC?M)在裸鼠体内肺转移的抑制作用。方法22只裸鼠,尾静脉注射接种ACC?M细胞建立实验性肺转移模型,随机分为紫杉醇组和对照组。紫杉醇组于接种肿瘤细胞后第2 天起腹腔注射紫杉醇10 mg/kg,3 d注射1次,共10次;对照组同期腹腔注射等量溶剂。接种6周后处死实验动物。观察发生肿瘤肺转移的裸鼠数目,称体质量;解剖裸鼠肺脏,称质量;记录肺转移灶数目。结果对照组和紫杉醇组相比,肺转移率100% vs 54.54%,肺转移结节数(28.64±10.69) vs (15.17±4.83),转移肺湿质量(0.702±0.044)g vs (0.524±0.046)ｇ,2组比较差别均有统计学意义(P<0.05)。结论紫杉醇对ACC?M细胞肺转移具有明显抑制作用。
【关键词】 癌 腺样囊性 紫杉醇 肺肿瘤 肿瘤转移
腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是口腔颌面部常见的唾液腺恶性肿瘤。国内统计腺样囊性癌占唾液腺肿瘤的9.95%,占唾液腺恶性肿瘤的24%,居第2位[1]。其主要表现为侵袭性强,易发生远处转移,以肺转移多见。目前多采用手术扩大切除辅以放、化疗的综合,但术后局部复发率高达42%,远处转移率可达32%[1?3]。目前,不少学者认为常用的化疗药物[如顺铂(DDP),5氟尿嘧啶(5?FU),阿霉素等]控制ACC转移的疗效不佳,因此选择特异性化疗药物始终是ACC治疗和抗转移的目标之一[1]。紫杉醇(palitaxel)是一种由红豆杉属植物的树皮提取的化合物,是近年来研究开发的一类化学结构新颖、作用机制独特的新型抗肿瘤药,具有抗肿瘤侵袭和转移的作用。已证实对晚期卵巢肿瘤、转移性乳腺肿瘤有明显疗效。笔者通过建立无胸腺裸小鼠实验性ACC肺转移动物模型,观察紫杉醇对ACC肺转移的抑制作用,了解紫杉醇动物体内抗ACC?M细胞肺转移能力。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1药品紫杉醇(泰素,美国百时美?施贵宝公司),原包装注射液30 mg/mL,保存在-20 ℃冰箱,使用时取1 mL用生理盐水配制成相应浓度为0.2 mg/mL的工作液,4 ℃冰箱保存;小牛血清(美国Hyclone公司);RPMI 1640培养基干粉(美国Gibco公司)。
1.1.2动物雄性,BALB/C,nu/nu,无胸腺裸小鼠,SPF级,6~8周龄,体质量18~20 g,由院上海实验动物中心提供[动物合格证号:SCXK(沪)2002?0012],福建医科大学动物中心饲养,饲料、水、饲养笼、垫料均经高压无菌消毒,SPF条件下饲养,所有操作均在超净台上处理。22只裸鼠等质量随机分为紫杉醇组和生理盐水组(对照组)，体质量差别无统计学意义[(20.3±1.64)g vs (20.6±1.38)g]。
1.2方法
1.2.1细胞培养肺高转移人涎腺腺ACC细胞株(ACC?M)由上海口腔医学研究所建株[4],由上海第二医科大学附属第九人民口腔颌面外科实验室提供。细胞培养在福建医科大学附属第一医院中心实验室进行。ACC?M细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,37 ℃、体积分数为0.05的CO2条件下培养,每3~4天按1∶4~1∶5传代。
1.2.2ACC?M细胞裸小鼠肺转移动物模型及药物用法(1)处于指数生长期的细胞经0.125%胰酶消化,吹打成单细胞悬液,细胞经1 000 r/min离心5 min,弃去上清,加入Hank's液吹打后再离心,重复3次,用无血清RPMI 1640培养液稀释,调整细胞浓度为5×106 mL?1备用;(2)裸鼠放入固定器中,在严格无菌条件下经尾静脉注入细胞悬液，每只0.2 mL(1×106个细胞);(3)细胞接种后第2天起,紫杉醇组每只按10 mg/kg紫杉醇腹腔给药,药物剂量参照[6]换算,3 d注射1次;对照组予同样体积的生理盐水,3 d注射1次,共10次,于接种后6周末断颈处死动物。
1.3观察指标给药期间观察裸鼠的一般情况,接种ACC?M细胞6周后断颈处死,称量裸鼠体质量;解剖肺脏,清洗后天平称肺质量;压片计数法记录肺转移灶数目;中性福尔马林固定肺组织,常规石蜡切片,H?E染色,进行组织病检查。
1.4统计学方法采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析,结果设α=0.05。裸鼠体质量、肺质量、转移灶数目用方差不齐的t'检验,转移率用χ2检验。
2结果
2.1肺转移动物数、肺转移率、肺表面转移结节数及裸鼠肺质量两组比较,差别有统计学意义(P<0.05,表1)。
2.2一般情况实验前对照组体质量与紫杉醇组差别无统计学意义。用药期间,紫杉醇组活动良好,饮食正常,未见感染及其他不良反应;对照组自第5周左右开始消瘦,体质量略有下降,2组比较差别无统计学意义(P>0.05,表1);动物心、肝、脾、肾组织无特殊病理改变,提示紫杉醇对裸鼠ACC?M肺转移灶生长抑制作用较好,毒副作用也较低。
2.3肿瘤标本ACC?M肺转移的裸鼠后期外形消瘦,体质量较未出现肿瘤肺转移者有一定程度的表1紫杉醇对ACC?M裸鼠肺转移的抑制作用下降。肺表面及实质内均可见圆形或椭圆形转移灶,呈散在性结节状突起。肺转移严重者瘤结节大而多,突出于肺表面,多个瘤结节融合成团。对照组ACC?M肺转移灶明显大于紫杉醇组,镜下见瘤细胞排列成实性团块,瘤细胞为圆形或多边形,排列紧密,细胞质少,细胞核较小呈圆形,核分裂较多见;瘤块中央见坏死灶,部分小血管内可见瘤栓(图1A)。紫杉醇组肺转移灶数量较少,瘤体较小,多分布于肺表面,镜下病灶小,瘤细胞体积小,细胞之间有裂隙,核分裂少,甚至仅可见肿瘤细胞团(图1B)。
3讨论
ACC是常见的唾液腺恶性肿瘤,生长缓慢但侵袭性强,易发生远处转移,以肺为多见,预后较差。多年来多种化疗药物被试用于临床,目前临床常用的化疗方案是1986年我国涎腺协作组制定的PVF(CDDP+VCR+5?FU)3周用药方案,但在控制ACC的肺转移未取得明显疗效[7]。
侵袭和转移是恶性肿瘤的特征。侵袭和转移并非完全呈连续性,有的侵袭并不一定最终表达转移,但转移是由多步骤侵袭而成的。肿瘤转移既与肿瘤本身的特性有关,又受宿主内在各种因素
制约,就肿瘤本身而言难以在体外进行研究[8]。ACC具有较高的肺转移倾向,ACC?M细胞株的筛选及动物模型的建立,为其转移机制和抗转移的研究提供了有力的手段。抗转移的动物实验模型应该最大程度反映转移过程的各种复杂关系。为更好地模拟转移全过程,目前常用的移植性肿瘤实验模型有自发性转移模型和实验性转移模型。实验性转移模型主要反映瘤细胞进入血循环后癌的几个转移步骤,与临床手术切除肿瘤后可能的血行转移相似。在新抗癌药物筛选中,常用移植性肿瘤实验模型。关晓峰等成功分离培养了ACC?M细胞株,并建立了肺转移裸鼠模型[4?5]。本研究中,使用实验性肺转移模型,模拟自发性肺转移模型作为抗肿瘤的研究对象,基本满足了研究需要,也为进一步系列研究ACC构建一个切实可行的研究平台。但在实验中尾静脉注射技术操作要求高,不易掌握;实验动物裸小鼠缺乏免疫反应,抗感染能力差,饲养条件要求较高。
紫杉醇是一种新的高效抗癌药物。一般认为紫杉醇的主要作用靶区是微管蛋白/微管系统。紫杉醇可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、装配,防止解聚,使微管稳定,从而阻止肿瘤细胞的生长[9]。近年来紫杉醇的抗侵袭转移能力及抗血管生成的作用渐渐为人们所认识[10]。在国内外的肿瘤研究中,实验研究发现紫杉醇具有抑制多种肿瘤细胞侵袭转移的能力[11?13],临床研究也表明紫杉醇对晚期卵巢肿瘤、转移性乳腺肿瘤治愈率为10％以上[14]。紫杉醇的体内抗肿瘤侵袭转移能力及其机制的研究还为数不多。
笔者在前期研究表明,紫杉醇对ACC细胞有较好的抗癌作用,在此基础上还进行了紫杉醇对ACC?M细胞侵袭能力的影响的体外实验,发现紫杉醇在体外能明显抑制ACC高转移细胞株ACC?M的侵袭能力,具有转移抑制潜能[15?17]。本研究则着重观察紫杉醇在裸鼠体内抑制ACC?M细胞株肺转移的能力,发现单独应用紫杉醇对移植在裸鼠体内ACC?M的肺转移具有显著抑制作用,其转移率降低,而且肺转移灶数目减少,含转移灶肺湿质量较对照组降低,转移灶计数多者其含转移灶的肺质量也增加,与对照组比较差别均有统计学意义(P<0.05)。紫杉醇组活动良好,饮食正常,未见感染及其他不良反应,体质量变化不明显;对照组由于ACC肺转移在晚期出现消瘦,体质量略有下降。
本实验表明紫杉醇在裸鼠体内具有很强的抑制ACC?M细胞株肺转移的能力。可望为临床有效治疗ACC提供新方法,其抗转移机制将进一步探讨。
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