丙戊酸钠诱导骨髓增生异常综合征细胞株 MUTZ?1凋亡的实验研究
作者：赵慧慧，陈宝安, 高冲，邵泽叶，夏国华，丁家华，孙耘玉，
【摘要】 为了探讨丙戊酸钠( sodium valproate， VPA)对骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ?1的生长抑制及诱导凋亡作用，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测VPA对细胞生长的抑制作用；采用光学显微镜和显微镜观察VPA作用后细胞形态的变化；应用流式细胞术(FCM)检测不同浓度VPA作用后细胞凋亡的比例和细胞周期分布的变化。结果显示： VPA对MUTZ?1细胞的生长抑制作用呈现时间和剂量依赖性；经4 mmol/L VPA处理MUTZ?1细胞72小时后,细胞呈现典型的凋亡形态特征，光学显微镜下可见凋亡细胞胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体；透射电子显微镜下可见凋亡细胞核染色质边集、胞浆浓缩、密度增加，胞浆内大小不规则的染色质团块；流式细胞术结果表明，细胞凋亡率随着VPA浓度的增加而逐步增高，G0/G1期细胞比例随着VPA浓度的增加而逐渐增多，S期细胞比例逐渐减低,细胞被阻滞在G0/G1期。结论： VPA通过G0/G1期阻滞诱导MUTZ?1细胞凋亡，从而抑制MUTZ?1细胞增殖。
【关键词】 骨髓增生异常综合征
Apoptosis of Human Myelodysplastic Syndrome Cell Line MUTZ?1 Induced by Sodium Valproate
Abstract To study the effects of sodium valproate (VPA) on human myelodysplastic syndrome cell line MUTZ?1. The cell proliferation was determined by MTT assay, apoptotic morphological features were observed by light microscopy and transmission electronmicroscopy, cell apoptosis and cell cycle shift were analyzed by flow cytometry (FCM). The results showed that VPA could inhibit the growth of MUTZ?1 cells in dose?and time?dependent manners. The typical apoptotic morphological features appeared in MUTZ?1 cells treated with 4 mmol/L VPA for 72 hours. Pyknosis of cells and nuclei, disintegration of nuclear chromatin and apoptotic body could be observed by light microscopy. Aggregation and margination of nuclear chromatin, concentration of plasm, increment of density and chromatin mass of irregular size could be observed by transmission electronmicroscope. The flow cytometric analysis indicated that the VPA could induce cell apoptosis, apoptosis rate increased in dose?dependent manner, ratio of cells at G0/G1 phase increased and ratio of cells at S phase decreased in dose?dependent manner, the cells were arrested at G0/G1 phase. It is concluded that the VPA can induce apotosis and inhibite proliferation of MUTZ?1 cells via arresting cells at G0/G1 phase.
Key words sodium valproate； MDS； MUTZ?1 cell line； apoptosis
J Exp Hematol 2007; 15(4):743-747
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组以血细胞质、量异常和高风险为急性白血病为特征的恶性克隆性造血干细胞疾病。由于本病具有高度的异质性,目前临床尚无明确有效的方法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI）可通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡抑制多种肿瘤细胞的生长增殖［1-3］，它的应用标志着一种全新的肿瘤治疗途径。丙戊酸钠(sodium valproate, VPA)是一种传统的抗癫痫病药物，毒副作用轻微，长期使用耐受性好，其在抗癫痫病有效治疗浓度时表现出很强的HDACI活性［4］。
本实验研究了VPA抑制MDS细胞株MUTZ?1生长增殖以及诱导其凋亡的作用。
制剂和试剂
VPA由连云港恒瑞制药厂惠赠,纯度为99.2% ,分子式为C8H15NaO2,以PBS配制成0.5 mol/L浓度,过滤分装,贮存于-20℃,实验证明所用药物浓度的PBS含量对细胞生长无影响。RPMI 1640培养液为Gibco公司产品，小牛血清购自杭州四季清有限公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）为Sigma公司产品，Annexin V?FITC凋亡和细胞周期分析试剂盒为Becton Dickinson公司产品。
细胞和细胞培养
人MDS细胞株MUTZ?1来源自德国Brauschweig细胞中心［5］。MUTZ?1是MDS?RAEB细胞系,免疫表型显示前B细胞的表面标记(CD10+,CD19+,cyIgM+),染色体核型表现为高频率的染色单体断裂及交换、5号染色体长臂的丢失［6］。细胞在5% CO2, 37℃条件下,用含10%小牛血清,青霉素(100 U/ml),链霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培养液培养传代。实验所用细胞均处于对数生长期，台盼蓝拒染法表明细胞活力＞95%。
MTT比色试验
取对数生长期细胞，洗涤，重悬于含10%小牛血清RPMI 1640培养液中，调整细胞终浓度为1×105/ml，接种于96孔板,加入不同浓度的VPA,每孔总体积为200 μl,另设空白孔和对照孔，每个浓度设5个复孔,分别于加药后0、1、2、3和4天进行检测,于每次检测前4小时每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl; 37℃，5% CO2条件下继续孵育4小时,然后终止培养，离心、弃上清,每孔加入150 μl DMSO,摇床混匀充分溶解结晶物；在全自动酶标仪波长540 nm处测定吸光度A值。试验重复3次,取平均值。
光学显微镜下细胞形态学观察
4 mmol/L VPA处理MUTZ?1细胞72小时后收集细胞悬液,离心 ,涂片,常规Wright?Giemsa染色,观察细胞形态。
透射电子显微镜下细胞形态学观察
4 mmol/L VPA处理MUTZ?1细胞72小时后收集细胞悬液,离心后快速固定于2.5%的冷戊二醛液中，2小时后，1%锇酸再固定1小时，丙酮梯度脱水，Epon?812树脂包埋，半薄切片定位，70 nm超薄切片，醋酸铀－柠檬酸铅双重电子染色，在JEM?1200透射电子显微镜下观察。
细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术检测
分别收集0、1、2和4 mmol/L VPA处理72小时的细胞, 4℃用PBS洗涤2次,1×Annexin?V缓冲液悬浮细胞,调整细胞浓度为1×106/ml,取100 μl悬液,加入Annexin?V?FITC 5 μl， PI 10 μl，避光孵育15分钟,每管加入300 μl的1×Annexin?V缓冲液,FCM检测凋亡细胞阳性率。Annexin?V(?)PI(?)为活细胞, Annexin?V(?)PI(+)为机械损伤细胞， Annexin?V(+)PI(?)为早期凋亡细胞, Annexin?V (+)PI(+)为晚期凋亡细胞，实验中以Annexin?V（+）作为凋亡细胞。
分别收集0、1、2和4 mmol/L VPA处理72小时的细胞(约2×106个),用PBS洗涤2次,用70%的冷乙醇于4℃下固定24小时以上,离心并重悬于1 ml PBS,加1 ml PC缓冲液,置室温20分钟,离心去上清,加100 μg/ml RNase 50 μl,再加入50 μg/ml PI 500 μl ,4 ℃室温避光30分钟，FCM分析细胞周期。
统计分析
应用SPSS 11.5统计软件进行统计,应用t检验分析实验组和对照组之间的差异,以p﹤0.05为差异具有显著意义。
结 果
VPA对MUTZ?1细胞生长的抑制作用
0.5 mmol/L VPA作用于MUTZ?1细胞后对细胞的生长增殖无明显影响（p﹥0.05），而较高浓度（1-6 mmol/L）的VPA可明显抑制细胞的增殖能力,且随着VPA浓度的增加及作用时间的延长,对细胞的生长抑制作用逐步增强,与空白对照组相比差异具有显著性（p﹤0.05）（表1）。
光学显微镜下细胞形态学变化
未经药物处理的空白对照组的细胞形态相对地比较规则，胞体大，胞浆较多；胞核大，核染色质细致，核仁清楚。而经4.0 mmol/L VPA作用的MUTZ?1细胞，72小时后显示凋亡的特征性改变：凋亡细胞胞膜完整、胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体（图1）。
透射显微镜下细胞形态学变化
未经药物处理的空白对照组的细胞胞浆内可见线粒体、内质网及少量空泡，细胞核大而圆，常染色质丰富，核仁明显，核浆比异常。经4.0 mmol/L VPA作用72小时的MUTZ?1细胞显示：凋亡细胞的核染色质边集、胞浆浓缩、密度增加，浆内可见大小不规则的染色质团块（图2）。
细胞凋亡的流式细胞术检测
不同浓度（1-4 mmol/L）VPA处理MUTZ?1细胞72小时后，与空白对照组相比，细胞的凋亡率明显提高。MUTZ?1细胞的凋亡率随着VPA浓度的增加逐渐增高，经1、2和4 mmol/L VPA作用72小时后细胞的凋亡率由处理前的1.39%上升为2.18%, 16.03%，22.02%（图3）。
Figure 3. Analysis of apoptosis in MUTZ?1 cells treated with VPA for 72 hours. A: control gruop. B: 1 mmol/L VPA. C: 2 mmol/L VPA. D: 4 mmol/L VPA.
细胞周期的流式细胞术分析
不同浓度（1-4 mmol/L）VPA处理MUTZ?1细胞72小时后，与空白对照组相比，G0/G1期细胞比例逐渐增多，而S期细胞比例逐渐减少, G2/M期细胞比例未见明显改变，说明VPA可将大部分细胞阻滞于G0/G1期（表2、图4）。
讨 论
细胞及有机体内组蛋白的乙酰化和去乙酰化之间存在着一种平衡。平衡是受到严格控制的,平衡的打破成为产生某些癌症或抑制另一些癌症的直接诱因［7］。恶性肿瘤的发生、过程中常涉及组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的异常募集,局部染色质的重塑被干扰,细胞发育、分化、凋亡过程中起重要作用的基因表达受抑,导致肿瘤的发生［8］。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI) 可以通过抑制HDAC活性,诱导组蛋白高乙酰化,调节基因表达,从而发挥抗癌效应 ［9］。HDACI的应用标志着一种全新的肿瘤途径。研究表明，HDACI能够诱导多种细胞生长停滞、分化或凋亡，目前已有多种HDACI进入了Ⅰ期/Ⅱ期临床试验。VPA是一种传统的抗癫痫药物，近年来发现其在抗癫痫病有效治疗浓度时表现出很强的HDACI活性；它可以通过诱导细胞周期停滞、细胞凋亡和分化抑制肿瘤细胞的生长增殖，对肿瘤细胞有选择性细胞毒性,而对正常造血细胞无严重毒性,且与多种化疗药物有协同作用［10］。目前VPA已经引起了人们的极大关注，但其抗肿瘤作用机制尚未完全明确，且国内的相关报道也少见。
我们前期的研究已证实羟基喜树碱［11］ 、维生素K2［12］对MUTZ?1细胞均有抑制增殖及诱导凋亡的作用。本实验以MDS细胞株MUTZ?1为靶细胞，观察VPA对细胞的生长增殖及凋亡的影响。MTT检测证实，随着VPA浓度的增加和作用时间的延长，MUTZ?1细胞的生长增殖逐步受到抑制。不同浓度VPA作用MUTZ?1细胞后,细胞周期分布情况也发生了改变：随着VPA浓度的加大，G0/G1期细胞比例逐渐增多，而S期细胞比例逐渐减少,表明经VPA作用后静止期细胞增多，而有丝分裂期细胞减少，细胞的增殖受到抑制。因此认为： VPA对人MDS细胞株MUTZ?1具有明显的增殖抑制作用。
凋亡是指在特定时空中发生的、受机体严密调控的自杀现象，是生物体内重要的生命现象，在控制细胞增殖、肿瘤的发生和生长中起着重要作用。肿瘤的发生发展不仅仅与细胞过度增殖有关,也与细胞凋亡水平的下降所造成的危险细胞清除不及时有关［13］ 。 本实验流式细胞术结果表明，随着VPA浓度的逐步增加，细胞凋亡率逐渐升高；同时经4 mmol/L VPA处理MUTZ?1细胞72小时后,细胞呈现典型的凋亡细胞的形态特征：光学显微镜下可观察到凋亡细胞胞体固缩、核固缩、核碎裂及凋亡小体；透射电子显微镜下可见凋亡细胞核染色质边集、胞浆浓缩、密度增加，浆内可见大小不规则的染色质团块。上述的形态学改变也证实了VPA对MUTZ?1细胞具有诱导凋亡的作用,与Kawagoe等［14］报道的VPA可以诱导RS4?11共9种白血病细胞株发生凋亡，并呈剂量依赖性的结果相近。因此，我们认为：VPA对MUTZ?1细胞的生长抑制作用是通过诱导其凋亡而实现的。
本实验结果表明： VPA通过G0/G1期阻滞，诱导MUTZ?1细胞凋亡，从而抑制MUTZ?1细胞增殖； VPA有望成为临床治疗MDS的新型药物。
【】
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