儿童急性巨核细胞白血病
【摘要】 本研究通过实例分析儿童急性巨核细胞白血病（AMKL）的临床、病理和生物学特征。用骨髓细胞涂片观察细胞的形态；用流式细胞技术和免疫组织化学方法检测肿瘤细胞的免疫表型。结果表明：本例以发热、出血、肝脾淋巴结肿大为主要临床症状，白细胞增多伴两系血细胞减少，骨髓干抽，骨髓原始巨核细胞异常增生超过30%，原始细胞的免疫分型为CD41+CD61+。骨髓活检显示，髓内增生的单个核大细胞为CD42b+。最后诊断为急性巨核细胞白血病。结论 儿童急性巨核细胞白血病较为少见，容易误诊，预后不好；免疫分型和免疫组织化学检测有助于该病的早期诊断和预后评估。
【关键词】 白血病 急性巨核细胞白血病 儿童
Childhood Acute Megakaryoblastic Leukemia
Abstract The aim of this study was to investigate the clinical, pathological and biological features of acute megakaryoblastic leukemia in childhood. The morphology of cells was observed by means of bone marrow smear; the immunophenotype was detected by flow cytometry and immunohistochemistry assay. The results indicated that the fever, hemorrhage, hepatosplenomegaly and lymphadenopathy in this case were the primary presentations accompanying by leukocytosis, anemia and thrombocytopenia. An adequate marrow aspirate could not be obtained. At the time of diagnosis, the bone marrow had more than 30% megakaryoblasts in nucleated cells. Flow cytometric analysis revealed the dual expression of CD41 and CD61 by tumor cells in bone marrow. The histopathological examination of bone marrow demonstrated infiltration of large?sized CD42b+ cells. According to all above mentioned results, this case was diagnosed as acute megakaryoblastic leukemia. In conclusion, childhood acute megakaryoblastic leukemia is a rare and easily misdiagnosed disease with poor prognosis. Flow cytometry analysis and immunohistochemistry assay of bone marrow can help in detecting this leukemia subtype and evaluating its prognosis.
Key words leukemia; acute megakaryoblastic leukemia; childhood
急性巨核细胞白血病（acute megakaryoblastic leukemia，AMKL ） 是巨核系造血细胞被阻滞在某一分化阶段并异常增殖所致的白血病。1963年，Lewis等［1］报道1例全血细胞减少的成年患者，该患者起病急，进展快，全血细胞减少，外周血有原始幼稚细胞；无脏器肿大；骨髓中网状纤维增生，有核细胞增生活跃，原始细胞和非典型的异常巨核细胞增多。该病例当时被命名为“急性骨髓纤维化”或“恶性骨髓硬化”或“急性骨髓增生异常伴髓外化生”［2］。自1931年首次报道1例儿童AMKL至1985年，儿童AMKL的病例报道仅有20例，发病率约占同期MDS/AML患儿的5%-7%（除了有Down综合症的儿童）［3］。1985年，急性巨核细胞白血病即FAB分型中的M7被正式命名。自此，Carroll ［4］、Lion ［5］和Creutzig等［6］报道家儿童AMKL占同期AML儿童患者的4%-7%。Rogelio等［7］统计墨西哥1990-2000年间834例白血病患儿，AMKL占同期AML的19.1%。儿童AMKL的发生率明显超过成人（0.5%-1.2%）［8］，应引起足够的重视。我国目前尚未见该病的病例报道及发病率的统计，分析原因可能为：对该病缺乏认识，常常被误诊为其他伴有原始巨核细胞异常的疾病，如慢性白血病（多是成人）、骨髓增生异常综合症（MDS）转化的白血病或者其它骨髓增殖异常的疾病。本研究通过我科近期收治的1例儿童AMKL病例来分析该病的临床特点、病理和生物学特征。
材料和方法
病例
患儿，女，1岁8个月。因发热伴皮肤出血点3月余入院。无血液病家族史，有反复牙龈出血史。入院查体：体温37.5℃，无先天愚型典型外貌，呈中-重度贫血貌，四肢可见散在淤斑、淤点，左枕后、右耳后各可扪及1个花生大小的淋巴结，右侧腹股沟可触及1个黄豆大小淋巴结，质硬，无压痛。肝右肋下5 cm、剑突下5 cm，脾肋下刚触及。余无阳性体征。化验结果：WBC 25.8×109/L，Hb 60 g/L，Plt 33×109/L，网织红细胞0.4%。肝肾功能正常，乳酸脱氢酶862 U/L。胸片未见异常，腹部B超提示肝脾肿大。3次骨髓常规检查均为干抽，经骨髓涂片、免疫分型及骨髓活检免疫组织化学检测确诊为AMKL。家长放弃而出院。
细胞形态学和细胞化学检测
骨髓涂片经常规瑞氏染色分类计数，并行髓过氧化物酶染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色及NaF抑制实验、糖原染色。
免疫分型检测
取肝素抗凝骨髓2 ml，分离单个核细胞，采用三色直接免疫荧光标记法。异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白荧光素（PE）或多甲藻叶绿素蛋白（Perep）标记的鼠抗人单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司产品）包括髓系相关的CD13、CD33、CD14、CD16、CD56、CD64、CD117和cMPO；T系相关的cCD3、CD3、CD4、CD5、CD7和CD8；B系相关的CD10、CD19、cCD79a、cIgM、Kappa和Lanbda轻链；干/祖细胞系的CD34和HLA?DR。100 μl单个核细胞悬液中加入荧光抗体20 μl，置室温避光孵育20分钟，再加入溶血素2 ml，震荡后置室温避光孵育10分钟，然后用2 ml PBS洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司产品）和CellQuest软件获取并分析10 000个细胞。胞浆抗原的检测参照渗透试剂盒说明书进行。通过CD45/SSC设门识别幼稚细胞群，再分析该细胞群的抗原表达情况。阳性判断标准：淋系抗原阳性细胞≥30%，髓系抗原阳性细胞≥20%，胞浆抗原阳性细胞≥10%，干/祖细胞抗原阳性细胞≥20%。分型依据欧洲白血病免疫分型组的积分标准（EGIL）。
免疫组织化学检测
石蜡包埋骨髓的活检组织，连续切片，厚5 μm。采用链酶亲和素?过氧化物酶法（SABC）检测。先将切片脱蜡水化，然后微波煮沸抗原修复2次各5分钟；以3% H2O2甲醛溶液阻断内源性过氧化物酶，37℃孵育30分钟；以非免疫动物血清室温封闭30分钟；加入一抗，4℃过夜；加入二抗，37℃孵育30分钟；加入酶结合物，37℃孵育30分钟；DAB显色，苏木素复染、分化、促蓝、脱水、透明、封片。鼠抗人单克隆抗体、SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中山生物技术有限公司。
细胞遗传学检测
取肝素抗凝骨髓2 ml，常规培养48小时，制备染色体标本，R显带，显微镜下分析20个中期细胞。按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）1995》描述核型［9］。
融合基因检测
采用多重巢式RT?PCR方法［10］筛选白血病29种染色体畸变形成的融合基因。对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色。
结 果
骨髓涂片结果
骨髓增生活跃，以巨核系增生尤著，占61%，其中原始巨核细胞占45%（大型37.5%、小型8%）（图1），可见幼稚巨核细胞（0.5%）、小幼稚巨核细胞（4.5%），偶见小型3核巨核细胞，分裂巨核细胞多见，占10%，伴颇多破溃凋亡细胞，粒系细胞（18.5%）和红系细胞（5%）明显受抑，血小板少，原始细胞POX染色阴性，诊断为AML?M7。对照血片：有核细胞轻度增多，原始巨核细胞（包括双原始巨细胞1%）占21%，淋巴比值较高占51%，中型成熟粒细胞仅占22%，可见有核红细胞（2个/100个有核细胞），血小板少，诊断为AML?M7。
免疫分型检测结果
分群图中R3占25.53%，表达CD61+CD41+（90.17%）和CD33（48.42%），CD34阴性（12.4%），为幼稚巨核细胞群（图2）。R2占42.54%，表达HLA?DR（55.22%）、CD19（31.64%）、CD20（30.1%）、CD4（33%）、CD5（69.7%）、CD7（69.49%）、cyCD3（57.88%）和cyCD79a（27.51%），为淋巴细胞群。R4占24.36%，表达CD33（20.87%）、CD13（88.7%）和cyMPO（89.8%），为成熟粒细胞群。R5占4.14%，为成熟单核细胞群。R6占2.13%，为有核红细胞和碎片。结合形态考虑为急性巨核细胞白血病，AML?M7。
免疫组织化学检测结果
骨髓活检组织中骨小梁间细胞成分密集，见多量体积较大的细胞，胞界不清，胞浆不明显，核大，染色质细。细胞核类圆、肾形，未见明显核仁。未见明显嗜酸性颗粒分化，其它造血细胞相对减少。可见分化较好的中性粒细胞、嗜酸粒细胞。未观察到成熟的巨核细胞。免疫组织化学检测显示（图3）：MPO-，Ki?67增生细胞+，CD20-，CD42b+，CD3-，CD43-。病理诊断为骨髓急性巨核细胞白血病（M7）。
Figure 3. Histopathology of bone marrow in the patient with acute megakaryoblastic leukemia. The tumor cells strongly express CD42b (SABC; ×400).染色体核型分析和融合基因检测结果
骨髓细胞染色体核型正常，为46XY。融合基因检测结果为阴性。
讨 论
长期以来，由于对巨核系前体细胞的形态和免疫学特点缺乏认识，我们一直认为AMKL是AML的一种罕见类型。随着超显微组织化学、免疫组织化学和血小板特殊糖蛋白单克隆抗体的，我们逐渐能够鉴别和定义巨核系前体细胞，因此发现AMKL的发生率比我们既往认为的要高得多［7］。AMKL在人群中的发病率有2个高峰：1-2岁的儿童和伴有骨髓纤维化的成年患者。儿童AMKL的临床表现与AML（M0-M5）相似，有乏力、出血、发热等，常伴脏器肿大，可有骨痛、关节痛、中枢神经系统症状、牙龈增生、口腔损害等。初诊时外周血中白细胞总数、血小板和白血病细胞数明显低于AML（M0-M5）［3］。常有骨髓纤维化，21%的AMKL患儿骨髓穿刺时出现干抽［7］。骨髓涂片显示，原始巨核细胞形态多样，胞体可非常小，伴致密的核染色质，也可较大的胞体伴细致网状的核染色质及1-3个明显的核仁，胞浆可见气泡。其形态有时难以和急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和AML相区别。原始巨核细胞的化学染色也无特异性，常显示髓过氧化物酶（MPO）和苏丹黑B(SBB)阴性，α?奈酚醋酸酯酶（ANAE）灶状阳性，不象单核细胞的弥漫阳性，高碘酸希夫染色（PAS）和酸性磷酸酶（ACP）也呈灶状阳性［11］。
AMKL的诊断主要依赖于免疫分型、免疫组织化学检测和显微镜检查。免疫分型：原始巨核细胞表达血小板特异的糖蛋白（CD41、CD42、CD36、CD61），是诊断AMKL最有价值的指标，其次为血小板过氧化物酶（PPO）。AMKL细胞常伴HLA?DR+和（或）CD34+，提示其来源于CFU?MK。在AMKL可出现表达粒系相关抗原CD33、CD13或CD11b的细胞群，该细胞群可能是原始粒细胞成分，尤其在原始巨核细胞少于50%的病例，但也可能代表同时表达粒系或巨核系抗原的原始巨核细胞群［11］。免疫组织化学表明与AML（M0-M5）不同，骨髓活检对AMKL的诊断具有更大的诊断价值，因为仅少数患者的骨髓涂片可见30%以上的原始细胞，而骨髓活检可见到许多小的原始巨核细胞和幼稚巨核细胞。骨髓中网状纤维增多，其原因可能为原巨核细胞分泌血小板衍化生长因子（PDGF）、TGF?β和纤维连接蛋白（fibronectin）等，促进成纤维细胞的化生［7］。电子显微镜检查：原始巨核细胞表面光滑，微绒毛很少，胞核大，核浆比例较高，细胞核呈圆形或卵圆形，常有凹陷，有时凹陷较深，以致切片时产生人为双核，核内常染色质占优势，异染色质分散，并在核周少量凝集。核仁较大，常见一个或数个，核孔较多，胞浆内有丰富的游离核糖体，粗面内质网较少。呈细管状分散存在，基质电子密度较高，高尔基体一般发育较好，细胞浆内可见少量致密颗粒，但未见血小板颗粒［2］。电子显微镜检血小板过氧化物酶（PPO）反应阳性。PPO反应的测定较CD41表型的测定敏感，但特异性比后者差，最好二者联用以减少误诊或漏诊。
AMKL的细胞遗传学特点目前尚不清楚，有关这方面的研究仍在进行中。AMKL的核型几乎均不正常［7］。报道的染色体异常有数种，如+21、inv(3)、t(1;15)(q10;q10)、t(11;14)(p13;q11)、t(1;22）(p13;q13)、t(3;3)(q21;q26)以及第3、5、7、8染色体的异常。这些染色体畸变没有特异性，也可见于其它类型的白血病、淋巴瘤［12］。M7伴Down综合征患者除+21外，很少合并其它异常核型。近来发现了一种独特的染色体易位t(1;22) (p13; q13)，仅见于儿童AMKL，不伴有Down综合症，其中67%为小于1岁的婴儿，至今这种易位尚未在其它AML亚型或ALL中发现［5］。费城染色体在AMKL的发生率从0%-17%不等，但是关于断点位置的分子数据尚未发现［12］。
我科该患儿首发症状为发热、出血、肝脾淋巴结肿大，与其他AML相类似，具有相对特异性的是：该患儿发病年龄较小（<2岁），符合儿童AMKL的特点。儿童M7的发病年龄相对于M0-M5来说较小，儿童M7几乎1/2在3岁以前发病，平均诊断年龄为2.2岁［7］，此年龄段M0-M5的发病率仅占儿童AML的18%，而多数AML的发病年龄大于3岁。该病人的外周血中未发现原始幼稚细胞，仅有白细胞增多及其它两系细胞的减低。AMKL的外周血中原始幼稚细胞较其它AML的少［4］，有的外周血中并不能找到原始幼稚细胞，这也是该病容易漏诊的原因之一。部分儿童AMKL伴发散在的溶骨损害。该患儿的多次骨髓检查均为干抽，提示伴有骨髓纤维化。患儿的骨髓象提示粒、红两系细胞增生低下，巨核细胞异常增高，其中原始巨核细胞占40%以上，且有淋巴样小巨核等多种大小形态不一的巨核细胞。诊断首先考虑AML，但需要与骨髓增生异常综合征（MDS）相鉴别。美国儿童肿瘤组（COG）统计60例MDS和53例AML（M7）患儿，认为两者的临床表现和预后相似［3］，并且有MDS向AMKL转化的病例报道［13］。所以鉴别诊断主要根据骨髓中原始幼稚细胞的比例，若>30%，诊断为AML［3］。但是仅仅凭借骨髓形态来鉴别AMKL和MDS有一定的难度，因为AMKL中有一部分原巨核细胞大小与原粒细胞相似，形态类似于淋巴细胞。而MDS的巨核系细胞可出现淋巴样小巨核、单圆核小巨核、多圆核巨核细胞等，且最小的小巨核细胞与原粒、原红在切片中难以区别。进行分类时，容易被归入正常淋巴细胞群中，结果可能导致原始幼稚细胞计数<30%。所以，用于区分MDS和AML的原始细胞比例阈值是反映基础疾病生物学行为的一个替代标志。对于骨髓原始幼稚细胞占20%-30%的患者，流式细胞术测定免疫表型有一定困难，应进一步通过骨髓活检和免疫组织化学检测来明确原始幼稚细胞的免疫表型，并结合细胞遗传学检查来明确诊断。我科该患儿免疫分型高表达CD41，CD61，CD38，CD33，部分表达HLA?DR，弱表达CD34，骨髓活检组织的免疫组化方法鉴定出原始巨核细胞。根据儿童AMKL的诊断标准：①外周血可见原巨核细胞；②骨髓有核细胞中原始+幼稚巨核细胞≥30%；③骨髓干抽，有骨髓纤维化；④骨髓活体组织检查可见原始巨核细胞增多，网状纤维增加；⑤电子显微镜下证实血小板过氧化物酶（PPO）呈阳性；⑥免疫分型证实白血病细胞的免疫表型为CD61、CD42或者CD41阳性。该患儿明确诊断为AMKL。AMKL的核型几乎均不正常［7］。婴幼儿M7患儿常伴有Down综合症。我科该患儿家长因问题拒绝做基因检查，所以缺少了这方面的资料。临床上发现部分患Down综合症的新生儿和某些虽然没有Down综合症临床表现，但染色体检查有21?三体嵌合体核型的新生儿，他们可能会出现短暂的原始幼稚细胞增殖［14］，其临床表现和血液学检查常常不能与先天的AML区别，类似于原始巨核细胞系的白血病。临床称为“短暂骨髓增生异常综合症”（transitory myeloproliferative disorder， TMD），是一种自限性疾病，一般不需抗白血病，通常可在诊断后数周或数月获得临床和血液学的完全恢复。然而，在白细胞过高的病例，也有必要服用细胞抑制剂，其中不到10%的患儿在4年内会发展为典型的AML，通常是AMKL［15］。近年来，在这一类病人的白血病细胞中发现了转录因子GATA1突变［14］。
因为临床病例少，关于AMKL的治疗尚无成熟经验，无特殊方案，常规化疗和缓解后异基因造血干细胞移植是目前治疗AMKL的主要手段。化疗方案与其它类型AML相同。美国儿童肿瘤组统计AML（M7）的诱导缓解率为66.0%，与MDS（57.1%）和M6（61.1%）类似，明显低于M0-M5（78.3%），诱导失败或诱导死亡是AMKL预后差的主要原因。AMKL患儿一旦获得完全缓解并接受了异基因造血干细胞移植，其5年无病生存率（38.0% ）与AML（M0-M5）相似（46.3%）［3］。伴有Down综合症的AMKL患儿（DS?AMKL）对化疗特别是大剂量阿糖胞苷敏感，8年无病生存率可以达到80%［16］，这可能是DS?AMKL的白血病细胞高表达CD36，从而增加了对阿糖胞苷、柔红霉素等药物的敏感性［17］。
综上所述，儿童急性巨核细胞白血病是一类临床较为少见，容易误诊，预后不好的疾病，免疫分型、免疫组织化学检测和电子显微镜检查有助于该病的早期诊断和预后评估。诱导完全缓解后接受异基因造血干细胞移植能够提高患儿的5年无病生存率。
【】
1Lewis SM, Szur L. Malignant myelosclerosis. Br Med J, 1963; 2:472-477
2Hassan HT, Freund M. Characteristic biological features of human megakaryoblastic leukemia cell lines. Leuk Res, 1995; 19: 589-594
3Barnard DR, Alonzo TA, Gerbing RB, et al. Comparison of childhood myelodysplastic syndrome, AML FAB M6 or M7, CCG 2891: Report from the Children′s Oncology Group. Pediatr Blood Cancer, 2006; ［Epub ahead of print］
4Carroll A, Civin C, Schneider N, et al. The t(1;22)(p13;q13) is nonrandom and restricted to infants with acute megakaryoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group Study. Blood, 1991; 78: 748-752
5Lion T, Haas OA, Harbott J, et al. The translocation t(1;22)(p13;q13) is a nonrandom marker specifically associated with acute megakaryocytic leukemia in young children. Blood, 1992; 79: 3325-3330
6Creutzig U, Harbott J, Sperling C, et al. Clinical significance of surface antigen expression in children with acute myeloid leukemia: results of study AML?BFM?87. Blood, 1995; 86: 3097-3108
7Paredes?Aguilera R, Romero?Guzman L, Lopez?Santiago N, et al. Biology, clinical, and hematologic features of acute megakaryoblastic leukemia in children. Am J Hematol, 2003; 73: 71-80
8Pagano L, Pulsoni A, Vignetti M, et al. Acute megakaryoblastic leukemia: experience of GIMEMA trials. Leukemia, 2002; 16: 1622-1626
9汪亚伦，王彤，许凤等. 伴有6；9染色体易位急性髓系白血病患者DEK?CAN融合基因表达分析. 实验血液学杂志，2006; 14：232-236
10李志刚，吴敏媛，朱平等. 白血病29种染色体畸变形成的融合基因分析. 中华儿科杂志，2001;39：682-685
11Athale UH, Razzouk BI, Raimondi SC, et al. Biology and outcome of childhood acute megakaryoblastic leukemia: A single institution′s experience. Blood, 2001; 97: 3727-3732
12Dastugue N, Lafage?Pochitaloff M, Pages MP, et al. Cytogenetic profile of childhood and adult megakaryoblastic leukemia (M7): a study of the Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique (GFCH). Blood, 2002; 100: 618-626
13de?Souza?Fernandez T, Ornellas MH, de?Carvalho LO, et al. Complex karyotype and N?RAS point mutation in a case of acute megakaryoblastic leukemia (M7) following a myelodysplastic syndrome. Cancer Genet Cytogenet, 2000; 117: 104-107
14Wechsler J, Greene M, McDevitt MA, et al. Acquired mutations in GATA1 in the megakaryoblastic leukemia of Down syndrome. Nat Genet, 2002; 32: 148-152
15Polski JM, Galambos C, Gale GB, et al. Acute megakaryoblastic leukemia after transient myeloproliferative disorder with clonal karyotype evolution in a phenotypically normal neonate. J Pediatr Hematol Oncol, 2002; 24: 50-54
16Gamis AS, Woods WG, Alonzo TA, et al. Increased age at diagnosis has a significantly negative effect on outcome in children with Down syndrome and acute myeloid leukemia: a report from the Children′s Cancer Group Study 2891. J Clin Oncol, 2003; 21: 3415-3422
17Savasan S, Buck S, Raimondi SC, et al. CD36 (thrombospondin receptor) expression in childhood acute megakaryoblastic leukemia: In vitro drug sensitivity and outcome. Leuk Lymphoma, 2006; 47: 2076-2083?
