CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）对于U937细胞的增殖、凋亡和分化的影响
作者：龚晴，郑金娥，刘伟，刘黎琼，李玥莹，黄士昂
【摘要】 CCL23/MPIF?1是人类趋化因子CC家族的一员，在血细胞中仅在单核细胞源的树突状细胞中持续表达，在体内和体外实验中对人、鼠的髓系祖细胞的增殖和分化均有明显的抑制作用。最近的研究发现，CCL23在儿童急性髓系白血病骨髓和外周血样本均有高表达。为了了解CCL23的高表达在白血病进展、和预后中的意义，选用白血病细胞系U937细胞作为研究对象，加入人类重组CCL23培养72小时，用CCK?8试剂盒测细胞增殖， FITC?AnnexinV/PI法检测细胞凋亡率，并观察不同处理条件下细胞分化情况及CCL23受体CCR1的表达水平。结果发现：单独的CCL23对于U937细胞的增殖、凋亡和分化无明显作用(P>0.05)；但在U937受PMA诱导分化的过程中， CCL23有明显的促分化作用，同时发现此过程中CCR1表达显著升高(P<0.05)。结论： CCL23对U937细胞无明显抑制作用，但可能与PMA产生协同诱导分化作用，而且该作用的出现可能与CCL23受体CCR1表达升高有关。
【关键词】 CCL23/MPIF?1；U937细胞；细胞增殖； 细胞凋亡；诱导分化
Effect of CCL23/ Myeloid Progenitor Inhibitory Factor 1 (MPIF?1) on the Proliferation, Apoptosis and Differentiation of U937 Cells
Abstract CCL23 is a human CC chemokine with potential suppression effects on both human and murine myeloid progenitor cells both in vitro and in vivo, and only expressed and released by dendritic cells differentiated from monocytes in blood cells. However, recent study has shown that CCL23 was over?expressed in bone marrow and peripheral blood cells from pediatric patients with acute myeloid leukemia (AML). In order to investigate the effects of CCL23 on the development, therapy and prognosis of leukemia, the U937 cells, a leukemic cell strain, were adopted and cultured with rhCCL23 for 72 hours. The cell proliferation and apoptosis rate were detected by Cell Counting Kit?8 and FITC?AnnexinV/PI respectively; the morphologic changes and the expression of CCR1 (the only receptor of CCL23 known by now) were observed during the differentiation process. The results showed that no obvious effect on the proliferation, apoptosis and differentiation of U937 was found by using CCL23 alone (P>0.05), but cultured in combination with CCL23 and PMA, the differentiation of U937 cells were promoted remarkably, during which the CCR1 expression increased (P<0.05). It is concluded that CCL23 alone did not inhibit the proliferation and differentiation of U937, while its use in combination with PMA may possess synergistic effect on inducting differentiation of U937 through the increase of receptor CCR1 expression.
Key words CCL23/ MPIF?1; U937 cell; cell proliferation; cell apoptosis; induction differentiation
CCL23，又称骨髓造血祖细胞抑制因子（myeloid progenitor inhibitory factor?1, MPIF?1）、巨噬细胞炎性蛋白3（macrophage inflammatory protein?3, MIP?3）、CKβ8、 CKβ8?1，是人类趋化因子CC家族（即β类趋化因子）中的一员，于1997年在人主动脉上皮细胞cDNA文库中分离得到［1］，其结构与造血抑制因子巨噬细胞炎症蛋白?1α（MIP?1α）高度同源［2，3,］。目前仅发现其与膜表面受体CCR1有高亲和力 ［4］，是其他β类趋化因子MIP－1α和RANTES的竞争配体［1,2,5］。CCL23在肝、肺、胰和骨髓组织中均有表达，且在单核细胞分化的树突状细胞中持续释放［6］，可以作为单核细胞、树突状细胞和静止T细胞的趋化剂［7］。此外在鼠和人的骨髓干细胞体外克隆培养实验中发现，CCL23对定向祖细胞有剂量依赖性的抑制作用［1］,可以减慢细胞周期［8］，从而在化疗过程中保护正常造血祖细胞抵抗化疗药物对快速增殖细胞的毒性作用［9,10］。同时其在体内实验中也有抑制多形核白细胞和单核细胞生成和释放的作用［11］。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)CCL23/骨髓抑制因子1（MPIF?1）对于U937细胞的增殖、凋亡和分化的影响最近一项研究在对急性髓系白血病（AML）患儿骨髓和外周血的基因芯片筛查过程中，发现CCL23有异常的高表达，且其表达水平随着化疗进行而下降，随复发而升高［12］。U937细胞是一种白血病单核系细胞株，易被PMA、GM?CSF等诱导分化，常用来研究体内造血过程［13，14］。本实验希望通过研究CCL23对于U937细胞增殖、凋亡和分化的作用,了解CCL23的表达在AML发病过程中可能的作用和对治疗的影响，并为进一步研究其作用机制和临床应用打下基础。
材料和方法
实验材料
U937细胞由同济医学院协和血液病研究所惠赠，rhCCL23（R&D公司产品）,PMA (Sigma公司产品)，培养液1640＋10％胎牛血清(Gibco公司产品），Cell Counting kit?8试剂盒（Technical Manual公司产品）, Annexin V?FITC kit试剂盒（Bender MedSystems公司产品），anti?CCR1(R&D公司产品), 流式细胞仪(FACSCaliburTM， Becton Dickinson公司产品), Elx800酶标仪(Bio?TEK Instruments公司产品)。
方法
细胞培养 将U937细胞培养在配好的培养液中，取对数生长期细胞进行实验。
细胞增殖检测 将U937细胞以2×105/ml×100 μl接种于96孔板中，加入试剂，在37℃、5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养一定时间。然后每孔加入CCK?8 10μl，放入培养箱，3小时后用Elx800酶标仪测吸光度。
细胞凋亡测定 将U937细胞以3×105/ml×1ml接种于6孔板中，加入试剂培养，用FITC?AnnexinV/PI法上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
细胞分化观察 观察培养后细胞形态由圆形或椭圆形悬浮细胞向梭形或形态不规则的贴壁细胞变化的情况。
CCR1的表达水平检测 采用流式细胞术检测U937本身以及加入PMA（50 ng/ml）培养24小时后CCR1的表达水平。
统计学分析
用SPSS统计软件进行t检验分析。
结 果
CCL23对U937细胞生长和凋亡的影响
在试验组细胞的培养液中加入CCL23（50 ng/ml），培养至24、48、72小时，镜下观察试验组细胞和未加CCL23的对照组细胞。结果发现在各个时间点，两组细胞的生长状态及数量变化均无明显差异。用CCK?8法衡量细胞生长情况:加入CCK8孵育3小时后，测450 nm的吸光度，其吸光度值与细胞数量和生长情况成正比。经3次重复实验，结果如图1所示。培养24小时，对照组吸光度平均值为2.2±0.097，试验组为2.314±0.128；培养48小时，对照组2.176±0.135，试验组2.288±0.143；培养72小时，对照组1.747±0.086，试验组1.733±0.141。两组无显著的统计学差异（P>0.05）。
细胞凋亡率的检测结果： 对照组凋亡率为3.67%±0.47%，试验组为3.78%±0.55%，两组均无明显统计学差异(P>0.05)（图2为3次实验中的1次检测结果）。
CCL23对于U937分化的影响
首先比较了CCL23单用对U937细胞的分化是否有影响,结果发现加入50 ng/ml的CCL23作用72小时后，试验组和对照组细胞在形态上无明显区别。随后，本实验研究了CCL23对PMA诱导的U937细胞分化的影响。结果表明,在培养72小时后,与单独使用PMA诱导的U937细胞相比,联合使用PMA(50 ng/ml)和CCL23处理的U937细胞产生了更多的梭形贴壁细胞,表明CCL23在体外可能协同PMA诱导U937的分化。
为了进一步了解CCL23和PMA的协同作用,我们用PMA(50 ng/ml)处理U937细胞24小时,结果U937细胞形态未发生明显变化。随后,用新鲜的RPMI 1640培养液洗涤细胞终止PMA的作用,然后将细胞等分为两份,并向其中一份加入50 ng/ml的CCL23，而另一份未加CCL23作为对照组。继续培养48小时后观察发现,未添加CCL23的对照组U937细胞仍然维持为圆形悬浮细胞的形态,而添加了CCL23的试验组中则出现了大量的梭形、多角形、不规则形状的贴壁细胞(图3)。
随后对U937细胞分化标志物CD14和CD11b表达的检测结果如图4所示。对照组细胞的CD14和CD11b的表达水平与其阴性对照相比，平均荧光强度比值(RFI) 小于2，表明其阳性表达很低；而加入了CCL23的试验组细胞CD14和CD11b的表达水平有明显升高（RFI>2）。重复实验3次，测得的CD14表达的RFI值：对照组1.07±0.04，试验组2.45±0.07；测得的CD11b表达的结果：对照组1.14±0.05，试验组2.58±0.08。两组间具有明显的统计学差异 (P<0.01)，提示试验组的分化程度明显高于对照组。
CCR1表达水平检测
由于CCR1是目前CCL23唯一已知的受体,本研究通过流式细胞仪检测CCR1水平以了解PMA处理是否能诱导U937细胞中CCR1表达。 在试验组细胞的培养液中加入PMA(50 ng/ml),而对照组细胞不加PMA,在相同条件下培养24小时后检测。结果表明，未处理的U937细胞本身CCR1表达不明显(RFI<2)，而经过PMA诱导24小时后,CCR1的表达即明显升高(RFI>2)。重复实验，对照组RFI值为1.22±0.08，试验组为2.09±0.07（图5）。两者之间具有统计学差异(P<0.01)。因此，PMA诱导的CCR1表达可能在CCL23和PMA的协同作用中发挥了重要作用。
讨 论
经过大量研究证实，CCL23作为一种骨髓祖细胞抑制因子，无论是在原代造血祖细胞的体外集落培养试验中，还是在体内试验中，对于正常祖细胞，尤其是髓系祖细胞的增殖和分化均有明显的抑制作用［15］。且其目前唯一已知的受体CCR1在正常骨髓造血细胞，包括各系造血祖细胞、单核细胞和淋巴细胞中均有表达［16,17,18］。因此不难理解，为什么生长旺盛的正常骨髓细胞不表达CCL23［6］。但最近的研究发现，CCL23在白血病病人的骨髓细胞中却有高表达，其在白血病发病和进展中的作用不明。仅在以往对于白血病病人骨髓细胞表面受体的筛查结果中发现：白血病细胞低表达或不表达受体CCR1［19］。因此，CCL23对于白血病细胞以及对白血病发病过程的实际作用情况有待研究。
U937细胞为白血病单核细胞株［20］，且本身无CCR1表达［14］，这样相似的条件为我们研究推测CCL23对于白血病细胞的作用有所启发。我们的研究发现：CCL23在体外对于白血病细胞系U937细胞的增殖、凋亡和分化都并无明显的直接影响,表明CCL23的高表达对白血病细胞自身并无明显影响，但CCL23可能通过抑制正常祖细胞的增殖，从而为白血病细胞的增殖提供有利的环境。这与肿瘤坏死因子α（TNFα）作用十分类似：白血病细胞高表达TNFα，后者对正常造血细胞有明显的抑制作用，但白血病干细胞本身对该因子的抑制作用并不敏感［21］。CCL23是否正是通过对周围细胞产生一种旁分泌作用来调节自身生长环境的，其中的具体机制还需实验证实，进一步的深入研究可能为了解AML的发病机制和新的化疗方案提供新的思路。
本研究中意外的发现，尽管CCL23单用不能影响U937的分化,但CCL23与PMA在体外具有协同诱导U937细胞分化的作用；而且进一步的试验表明，单独的CCL23足以诱导经过PMA预处理的U937细胞发生分化,这一作用并不需要PMA始终存在。U937细胞本身并不表达CCR1 ［14］，但我们发现经过PMA诱导后U937细胞的CCR1表达水平显著上升。由于CCR1是目前CCL23唯一已知的受体,这提示PMA诱导下CCR1的表达可能是CCL23产生作用的基础。当然,考虑到CCL23通过CCR1对正常骨髓细胞分化的抑制作用［4］,也不排除PMA处理诱导了其他CCL23未知受体表达的可能性,从而使得CCL23可以诱导经PMA处理的U937细胞发生分化,其中详细的信号通路以及分子机制有待深入研究。有意义的是，有研究发现GM?CSF也有诱导U937细胞表达CCR1的作用［14］，那么CCL23是否同样可以与之协同诱导白血病细胞的分化，以及CCR1在其中的作用机制如何？这些研究可能将有助于我们进一步了解CCL23在AML发生发展机制和临床中的作用和应用前景。
【】
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