HFCL细胞诱导HL?60细胞分化和改变其基因表达谱的研究
作者：梁蓉，黄高昇，陈协群，白庆咸，王 哲，董宝侠，王文清，张伟平
【摘要】 本研究探索正常人骨髓成纤维细胞样基质细胞（HFCL）对急性髓系白血病HL?60细胞增殖分化影响的分子机理。采用流式细胞仪检测细胞周期，NBT还原实验和CD11b、CD14、CD13、CD33细胞表面抗原的测定检测细胞的分化；应用基因芯片技术检测HL?60细胞与HFCL细胞共培养前后基因表达谱的改变，并采用半定量RT?PCR、Northern blot对芯片结果进一步验证。结果发现，HL?60细胞与HFCL细胞共培养后，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少；NBT阳性细胞增高，CD11b和CD14的表达增多，并有明显的统计学意义；基因表达谱改变的研究发现，在与HFCL细胞共培养后，HL?60细胞中582 个基因表达上调，1 323个基因表达下调。结论： HFCL细胞能诱导HL?60细胞部分分化，并能明显改变HL?60细胞的基因表达谱，为研究基质细胞与白血病细胞之间的相互关系及重要信号分子传导途径或cross?talk等提供了新的线索。
【关键词】 急性髓系白血病 骨髓成纤维细胞样基质细胞 HL?60细胞； 基因芯片； 基因表达谱
Differentiation of HL?60 Cells Directly Cocultured with HFCL Cells and Alteration of Their Gene Expression Profile
Abstract To study the molecular mechanism of the effect of fibroblastoid stromal cells (HFCL) from human bone marrow on the proliferation and differentiation in acute myeloid leukemia HL?60 cells, the cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM); the cell differentiation was determined by morphology NBT test and flow cytometric detection for expression of CD11b, CD14, CD13 and CD33; the genes differently expressed between HL?60 cells and HL?60 cells directly cocultured with HFCL were detected by using Affymetric oligo microarray technique. The changes of expression in some key genes were confirmed by using RT?PCR and Northern blot. The results showed that the percentage of G1 phase cells in AML cells cocultured with HFCL cells was higher than that without HFCL cells, and the percentage of S phase cells was lower. The NBT positive cells and the expression of CD11b and CD14 increased. It was found that after direct contact of HL?60 cells with HFCL cells for 96 hours, the expression levels of 582 genes were up?regulated, 1 323 genes down?regulated. It is concluded that many genes may take part in the influence of HFCL cells on HL?60 cells, which may give important insights into the important molecules and pathways or cross?talk involved in the interaction between the AML cells and stromal cells.
Key words acute myeloid leukemia; human bone marrow fibroblastoid stromal cell; HL?60 cell; gene chip; gene expression profile
骨髓基质细胞是造血微环境的主要成分，通过分泌细胞因子、直接黏附，对正常造血具有调控作用［1，2］。和正常造血细胞一样，白血病细胞也依赖造血微环境存活。近年来国内外研究越来越发现，微环境在白血病细胞恶性克隆的选择、增殖、分化、迁移和凋亡中起重要作用［3，4］。我们研究发现，正常骨髓成纤维样基质细胞(HFCL)能抑制急性髓系白血病HL?60细胞的增殖，抑制细胞周期，影响VEGF因子的表达［5］，但究竟通过什么分子机理目前还不清楚。基因芯片技术以其高通量、高灵敏度，为疾病基因表达研究提供了一种简洁实用的方法。据此， 本研究采用Affymetric Genechip Human Ge?nome U133A来检测HL?60细胞与HFCL细胞共培养前后的基因表达谱的改变，并通过进一步的筛选和分析，以探索HFCL细胞对HL?60细胞增殖影响的分子机理。
材料
正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL来源于正常人胎儿骨髓基质细胞，由医学院血液学研究所姜学英教授建系，军事医学科学院基础医学研究所张毅博士提供。人急性髓细胞白血病细胞株HL?60为本室保存株。实验用细胞均处于对数生长期。IMDM、RPMI 1640培养为Gibco公司产品，新生牛血清为HyClone公司产品；全基因组表达芯片U133A（美国Affymetrix公司产品）；TRIZOL reagent（美国Invitrogen Life Technologies公司产品）；RNeasy Mini Kit （美国Qiagen公司产品）；Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit、Fluidics Station 400、Hybridization Oven 640、G2500AGe?neArray Scanner、Microarray Suit Version 5.0、MicroDB Version 2.0、Data Mining Tool Version 2.0均为美国Affymetrix公司产品；pMD 18?T Vector为TaKaRa大连有限公司产品；E.Z.N.A?Plasmid Miniprep Kit I为美国Omega Bio?tek公司产品；NucleoSpin Extraction Kit为美国Clontech公司产品；NorthernMaxTM Formaldehyde Load Dye为美国Ambion公司产品；DECAprimeTM II Random Priming DNA Labeling Kit为美国Ambion公司产品；ExpressHyb Hybridization Solution为美国Clontech公司产品；尼龙膜为美国Clontech公司产品；同位素［α?32P］dATP购于北京亚辉生物技术公司。
体外共培养体系
对照组：单独培养HL?60细胞。共培养组：先种HFCL细胞48小时后，再在已贴壁的HFCL细胞上直接加入悬浮生长的HL?60细胞。
扫描电镜检测
观察白血病细胞和HFCL细胞共培养48小时的形态学表现。先把细胞铺片放入细胞培养皿中，把胰酶消化后重悬的HFCL细胞加入到培养皿中，于37℃含5% CO2的细胞培养箱中培养48小时后，再加入HL?60细胞继续培养48小时，用PBS洗2次，送电镜室后，加入4℃预冷的3%戊二醛固定2小时，PBS洗2次，再用4℃预冷的1%锇酸固定1小时，脱水干燥后在S?520型扫描电镜下观察细胞形态。
NBT还原阳性率测定
离心收集单独培养的HL?60细胞及与HFCL细胞共培养96小时的HL?60细胞，重悬于培养液中（细胞密度1×106/L），加入终浓度为0.1%NBT及100 μg/L TPA，于37℃，5% CO2培养箱中孵育30分钟，离心收集细胞涂片，进行Wright?Giemsa染色，油镜下观察200个细胞，胞内有蓝紫色颗粒的细胞为NBT阳性细胞，阳性细胞率。
细胞周期的流式细胞术
分别收集HL?60细胞及与HFCL细胞共培养96小时的HL?60细胞各1×106个，制成细胞悬液，用PBS洗涤2次，离心去上清，加入1 ml PBS和2 ml 无水乙醇固定1小时，再次洗涤后，加入DNA?Prepstain染液染色，用EPICSXL?MCL流式细胞仪(Coulter公司）检测各组细胞的细胞周期时相的荧光强度，用DNA Multi Cycle软件进行统计学拟合分析。
细胞膜表面分化抗原的免疫荧光检测
制备各实验组及对照组活细胞悬液100 μl（细胞数1×106个细胞），分别加入小鼠抗人CD11b和CD13、CD14、CD33?FITC荧光标记的单克隆抗体工作液10 μl、20 μl、20 μl 、20 μl和正常兔血清5 μl封闭，充分混匀后室温避光放置30分钟，洗涤液（DPBS， 5% FCS和0.2% NaN3）洗2次，每次5分钟，弃上清，加入终浓度2%的多聚甲醛固定液500 μl重悬细胞，上流式细胞仪（FCM）检测。以无关抗体为阴性对照。
RNA样品的制备、基因表达谱的检测和结果分析
分别收集HL?60细胞和与HFCL细胞共培养96小时的HL?60细胞，用TRIZOL试剂提取总RNA。先经过TEST测试芯片进行标记样品的质控（TEST芯片的杂交检测）后，再进行Affymetrix的全基因组表达芯片U133A的检测，按照Affymetrix的基因表达芯片操作指南进行，由上海晶泰生物技术公司提供技术支持。用TRIZOL试剂提取总RNA，RNeasy Mini Kit 纯化RNA；两个样品以5 μg左右等量的总RNA为模板合成cDNA，采用SupperScript Choice system(Life Technologies,Grand's Land, NY)，poly(dT)?T7引物(Genset, Lajolla, CA)。体外转录以双链cDNA为模板，采用Enzo BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit标记上生物素的UTP和CTP。生物素标记的cRNA经过纯化和片段处理，然后与芯片杂交。芯片在基因芯片清洗工作站（GeneChip Fluidics Station400, Affymetrix）洗脱后，用链酶亲和素?藻红蛋白进行染色处理。用Affymetrix GeneArray Scanner扫描检测信号。
每个基因由一个或多个转录本片段对应的探针组所代表，芯片上的每个基因或EST都是由11对20 mer的探针组成，其中一个是完全匹配（perfect match, PM）的 ，另外是序列中间有几个碱基错配（mismatch MM），通过计算PM和MM寡核苷酸的差异，并把PM?MM平均信号强度作为常数，以去除交叉杂交的数据。在Affymetrix Genechip expression analysis softmare version 3.0、MicroDB Version 2.0、Data Mining Tool Version 2.0上进行分析扫描仪产生的杂交图像的信号强度，数据经过筛选集中和统计学分析，每个基因都得到一个平均的强度，自动判断其上的基因型，由于基因的低表达，两个样品的基因表达差异在100至200之间被认为没有差异，再进一步筛选出两个样品的表达差异基因。这些基因可以通过GenBank上网查询信息。
进一步的芯片验证
选择基因表达变化最明显的基因进行验证。
半定量RT?PCR
用TRIZOL提取对照组和共培养组细胞的总RNA，并用紫外分光光度仪进行定量。分别取等量RNA用Superscript II反转录酶反转录。然后以反转录产物为模板，PCR扩增目的条带HL14基因(上游：5'?GAC CTG GGG AAC CGA ACA CC?3'；下游：5'?AGG CAA CGC ACT TTA ATC TTG AA?3')。同时扩增β?actin（上游：5'? TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT? 3'；下游：5' ?CAA GAA AGG GTG TAA CGC AAC TA ?3'）作为内参照。PCR反应体系为50 μl，HL14基因的反应条件： 94℃ 5分钟后，94℃ 30秒，58 ℃ 30秒，72 ℃ 1分钟，30个循环后，72℃ 10分钟； β?actin的反应条件： 94℃ 5分钟后，94℃ 40秒，55 ℃ 40秒，72 ℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 5分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离。
以HL?60和与HFCL细胞共培养后的HL?60 cDNA为模板，PCR反应扩增目的条带，用NucleoSpin Extraction Kit从琼脂糖凝胶中回收目的片段。将纯化的目的片段克隆入T?Vector并测序。经测序证实后，用DECAprimeTM II Random Priming DNA Labeling Kit随机引物标记法标记32P?dATP来制备探针， NucleoSpin Nucleic Acid Purification Kits去除游离的同位素及其它杂质。按照分子克隆第三版的方法，分别提取对照组和共培养组的HL?60细胞的总RNA，经紫外分光光度仪定量后，取等量RNA加入3倍体积的NorthernMaxTM Formaldehyde Load Dye，65℃水浴变性15分钟，并立即放置冰上，离心后上样。1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳至2/3处，真空转印至尼龙膜；同样再进行1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，取出凝胶并浸入含有EB的醋酸铵染色1小时，紫外灯下观察电泳结果，并照相记录。将快速杂交液预热至68℃备用，把膜放入杂交瓶中，6 ml杂交液68℃杂交炉内预杂交30分钟；每份探针煮沸2分钟变性，变性的探针立即放入冰水中；去预杂交液，加入快速杂交液6 ml于杂交炉中68℃杂交3小时，中等严谨度洗膜，除去膜上多余水分，包以保鲜膜后，-70℃放射自显影。
统计学处理
细胞增殖分化实验结果应用SPSS 10.0统计软件进行卡方检验、 t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
结 果
HL?60细胞及与HFCL细胞共培养的HL?60细胞的变化
扫描显微镜检显示，HFCL细胞成纤维细胞样贴壁生长，并部分已融合。在HFCL 细胞上加入HL?60细胞后24小时，发现大部分HL?60细胞已黏附在HFCL细胞上；轻轻吹打后，仍有部分紧密黏附在HFCL细胞上，通过扫描电镜观察发现，紧密黏附在HFCL细胞上的HL?60细胞似乎嵌入到HFCL细胞浆内，其伪足与HFCL细胞的伪足相连接（图1）。
共培养后HL?60细胞周期的变化
FCM检测证实，与单独白血病细胞(对照组)相比，HL?60与HFCL细胞共培养后96小时后， G0/G1期细胞比例增加（42.3% vs 51.6%），S期细胞比例减少(43.5% vs 37.1%)，差别均显著（P<0.05）。
NBT还原率的变化
中性粒细胞及单核细胞具有过氧化物酶可接受NADPH来的氢，将硝基蓝四氮唑（NBT）还原变成难溶性蓝黑紫色颗粒，沉着于有酶活性的部位，未成熟的白血病细胞则缺乏这种能力。通过检查200个细胞，计算NBT阳性反应百分数，是一种判断诱导分化率的常用指标。本实验发现，与单独培养组相比， HL?60细胞与HFCL细胞共培养96小时后，NBT阳性细胞率增高（3% vs 11.7%）
白血病细胞表面分化抗原表达变化
CD11b、CD13、CD14和CD33均属髓系特有的分化抗原，只有CD14属单核细胞较特异的抗原。CD11b增高表示细胞向粒?单核细胞方向分化成熟。本研究用小鼠抗人CD11b和CD13、CD14、CD33?FITC荧光标记的单克隆抗体通过FCM检测细胞膜表面抗原的荧光强度。结果发现，对照组HL?60细胞CD11b和CD14的表达均<1%，HL?60与HFCL细胞共培养96小时后，CD11b和CD14的表达分别增高至10.63%和7.45%（P<0.05），而CD13和CD33变化不大。
与HFCL细胞共培养前后HL?60细胞基因表达谱的变化
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 setA是一种人类全基因组寡核苷酸芯片，它共涵盖18，000多个转录本（本实验实际22 283个），代表了18 000多个明晰的基因，其中13 000多个为全长基因。序列来自GenBank、dbEST、Unigene 和RefSep等数据库，经过精心筛选，有利于高通量并行分析人类基因表达的变化。该芯片采用高效准确的光蚀刻原位合成技术，具有独特的PM?MM探针设计，这样能有效地区分有同源性的基因序列，克服了背景噪声、错误和偏差，避免了同源性的基因序列与探针交叉杂交而引起的假阳性和判断错误。MM探针还是有效的内参照，它可以将与非特异性序列结合的背景信号有效地定量扣除，这样可以提高探针的灵敏度和特异性。我们应用该芯片比较 HL?60在与HFCL细胞共培养前后基因表达谱的变化。经数据分析后发现，与HFCL细胞共培养96小时后HL?60细胞的582个基因表达上调，其中上调5倍或以上的基因有如HL14 gene encoding beta?galactoside?binding lectin（555.19倍）、proteinase 3 (PRTN3) （13．18倍）、protein tyrosine phosphatase, non?receptor type 3 (PTPN3)（9．02倍）等；同时1,323个基因表达下调， 其中下调5倍或5倍以上的基因如hum?a?tub2 alpha?tubulin（24.04倍）、interleukin 5 receptor alpha?subunit（13.84倍）等。
芯片结果的验证
采用半定量RT?PCR检测HL14基因的表达显示，HL14基因在HL?60细胞无表达，而共培养后表达明显增强，有一个181 bp目的条带；这与芯片测定结果相一致（图2）。采用Northern blot分析共培养前后HL14基因的表达变化，探针序列分析结果与GenBank公布结果一致（HL14 M14087.1），其结果显示HL14基因在HL?60细胞不表达，而共培养后表达明显增强；这与芯片测定结果相一致（图3）。
讨 论
我们研究曾发现，与HFCL细胞共培养后，HL?60细胞的增殖受抑，伴有增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）和血管表皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）表达降低［5］。本研究发现，与HFCL细胞共培养后，HL?60细胞出现G0/G1期阻滞，NBT阳性细胞增多，CD11b和CD14表达增高，这表明部分细胞向单核细胞方向分化。为了探讨骨髓基质细胞对AML细胞生存影响的分子机理，本实验采用Affymetrix GeneChip Human Genome U133 setA检测AML细胞系HL?60在与正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL共培养前后基因表达谱的变化，以期能为今后的进一步的分子机制研究和临床提供新的线索。
人类全基因组U133A芯片是高密度寡核苷酸芯片，它具有独特的PM?MM探针设计，可提高探针的灵敏度和特异性，重复性好，假阳性率非常低，可以定量地研究全基因的表达谱变化，是世界上最先进的基因芯片，已经被广泛应用于基因表达分析、基因分型和健康诊断的研究［6-8］。本研究发现，与HFCL细胞共培养96小时后，HL?60细胞有582个基因表达上调，1 323个基因表达下调。 通过检测，变化最明显的HL14基因的表达也进一步验证了芯片结果。
在这些变化的基因中，有一些与细胞增殖有关，如PCNA表达下调，而有些被认为具有增殖抑制作用的基因表达上调，如胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin?like growth factor binding protein, IGFBP?5) , 阻殖蛋白（prohibitin)。这也进一步说明了HFCL细胞能抑制HL?60细胞的增殖，而且可能与这些基因的表达调控有关。在这些变化的基因中，许多被证实在髓细胞的分化中起重要作用，包括上调的基因interleukin 8 (IL8)、MPO、CD11b、C/EBP?induced protein、CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) alpha、estrogen?responsive B box protein (EBBP)、TNF receptor associated protein (TTRAP)，和下调的基因Traf2 and NCK interacting kinase、ARP2 actin?related protein 2 homolog、3?oxoacid CoA transferase (OXCT)、succinate?CoA ligase、ADP?forming beta subunit、Acyl?CoA synthetase 3、stearoyl?CoA desaturase、insulin?like growth factor 2 receptor (IGF2R)、intercellular adhesion molecule 3 (ICAM3) 和annexin AII［9?11］。这些发现提示，参与HFCL细胞诱导HL?60细胞分化的基因或分子机理可能与药物如维甲酸等诱导HL?60细胞分化的机制相似，换句话说，无论外界刺激如何，髓细胞的分化成熟有其自己共同的信号传导途径。
许多研究表明，诱导髓细胞分化，需要有相关基因的激活，并伴有G0/G1受阻。本实验研究发现，与HFCL细胞共培养后，HL?60也出现G0/G1阻滞和S期细胞减少，有部分分化现象，芯片结果也显示与其相关的基因表达下调，如ras、ras?related C3 botulinum toxin substrate 2(RAC2)、CDC20、cyclin E2、S100 calcium?binging protein P、cell cycle progression 8 protein、TTK protein kinase、activator of S phase kinase、E2F transcription factor 3、G2 and S?phase expressed gene。然而，仍有一些基因的变化难以解释，如p18、p19和p27kip1基因的上调。而HL14基因编码的 beta?galactoside?binding lectin的变化最明显，增高了555.19倍。这个基因是1986年克隆的一个新基因，其功能现在还不是很明确，目前研究发现，它是一种细胞增殖的自分泌调节剂，在G0期细胞的维持和控制细胞通过G2期的过程中起重要作用［12］，它在HL?60细胞和HFCL细胞之间相互作用中到底起何作用，还有待进一步研究。
AML细胞表达许多黏附分子，其部分黏附至少是通过VLA?5与fibronectin和β1(VLA?4)或β2(LFA?1)整合蛋白与基质细胞相互作用来完成的［13］。在本研究中也发现，与HFCL细胞共培养中HFCL细胞对HL?60细胞增殖、分化和凋亡调控中的作用最大，说明两种细胞之间黏附分子及其信号传导途径在其中起关键的作用。芯片检测结果也显示，一些黏附信号分子基因表达上调，如Tax interaction protein 40 (TAX40)、syndecan?1 gene、tight junction protein 1 (TJP1)、proteinase 3 (PRTN3)。这些基因参与细胞与细胞之间的相互作用和细胞之间的黏附［14，15］，这提示它们可能在HFCL细胞对AML细胞增殖、分化和凋亡调控中也发挥着重要功能。然而，它们是如何参与调节细胞增殖和分化以及它们与增殖、分化和细胞周期相关基因有何cross?talk，这还需今后进一步研究探讨。
在本实验中我们应用先进的基因表达芯片发现了HL?60细胞在与HFCL细胞共培养前后，一些基因表达发生了显著改变，包括上述与增殖、分化、凋亡和黏附相关的基因，这为深入研究骨髓基质细胞在白血病发生和中的作用及其分子机制，为今后临床新的治疗策略提供了有价值的线索。
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