慢性粒细胞白血病患者胸腺输出功能与 bcr?abl mRNA水平的关系
【摘要】 本研究了解慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia， CML）患者体内T细胞受体重排删除环（T cell receptor rearrangement excision circles， TREC）的含量与bcr?abl mRNA水平的关系，进而明确CML患者的胸腺近期输出功能测定对疾病预后判断的意义。实时定量PCR检测15例CML?CP患者外周血TREC含量及bcr?abl融合基因转录本的水平，并追踪检测6例患者bcr?abl水平的变化。结果发现： 在CML初发时患者外周血TREC含量与bcr?abl融合基因水平无明显的相关性；随访2年后，TREC含量高的患者bcr?abl水平下降幅度更大, 而在接受造血干细胞移植的2例患者中，移植前TREC含量相对较高者，移植1年后连续3次均检测不到bcr?abl，另1例则检测到低水平的bcr?abl。 结论： CML患者胸腺输出功能较高者，可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助。
【关键词】 慢性粒细胞白血病 胸腺输出功能 bcr?abl融合基因 TREC
Relationship Between Thymus Output Function in CML Patients and Their bcr?abl mRNA Levels
Abstract The study was purposed to analyze the relationship between the content of T?cell receptor excision DNA circles (TREC) and bcr?abl mRNA levels in CML patients and to evaluate the prognostic significance of recent thymic output function detection in patients with chronic myelogenous leukemia (CML). Quantitative detection of TREC and bcr?abl fusion gene transcripts in peripheral blood from 15 CML patients were preformed by real?time PCR. The change of bcr?abl levels in 6 patients was followed?up for two years. The results showed that there was no significant correlation between TREC and bcr?abl mRNA levels in peripheral blood from CML patients for the first attack. Patients who had higher TREC at diagnosis had a larger reduction of bcr?abl after 2 years of follow?up. While out of 2 patients who underwent haemopoietic stem cell transplantation(HSCT), one patient with higher level of TREC before transplantation was confirmed to express undetectable level of TREC by three consecutive detections after transplartation, other one patient was identified to express low level of bcr?abl. It is concluded that high thymic output function in CML patients can be beneficial for killing the residual CML cells.
Key words chronic myelogenous leukemia; thymus output function; bcr?abl fusion gene; TREC
肿瘤的发生与机体免疫功能障碍有很大关系，患病机体的免疫状况可影响肿瘤的进展、演化以及预后。胸腺是免疫系统的中枢免疫器官，其功能状态直接决定机体细胞免疫功能,并间接影响体液免疫功能。T细胞受体重排删除环（T cell receptor rearrangement excision circles, TRECs)是胸腺内T细胞受体重排的副产物，可作为胸腺近期输出功能的标志［1］。行造血干细胞移植的患者，移植前或初诊时的胸腺近期输出功能与移植后相关并发症的发生或存活情况相关，它可作为判断预后的一个指标［2，3］。HIV感染患者，外周血中TREC含量与HIV RNA水平呈负相关［4］。而CML患者的TREC含量与bcr?abl融合基因水平的关系以及对于疾病预后判断的意义尚不清楚。
患者资料
经细胞形态学、细胞组织化学和细胞及分子遗传学确诊的CML患者15例（男10例，女5例），中位年龄31（15-66）岁，均为初诊慢性期患者，并对其中6例患者bcr?abl融合基因水平进行追踪检测，4例患者均以干扰素复合羟基脲，2年后仍处于慢性期，另外2例确诊半年内进行了异基因造血干细胞移植，收集患者外周血标本共21份。
标本处理
采用淋巴细胞分层液分离获得单个核细胞，取其中约1×105个细胞,应用CD3单克隆抗体和免疫荧光标记方法检测CD3+细胞阳性率，余细胞一部分按常规方法（酚抽提法）提取DNA；另一部分用于提取RNA（TRIzoL，Invitrogen产品），并应用随机引物和反转录酶试剂盒（Superscript III，Invitrogen产品）反转录合成cDNA第一链，操作按说明书进行。
TREC的定量检测
引物设计
从TCRδ基因组序列（ACCESSION AE 000661）中于δRec基因片段的下游设计1个下游引物（T1）和在ψJα的上游设计1个上游引物（T2），引物的方向恰好与一般的PCR引物相反，并在该扩增片段中间设一荧光素标记探针（T3）；选择rag2基因作为细胞定量对照，分别在rag2基因组序列（ACCESSION M94633）中设计1对引物（R1和R2）及1个荧光素标记探针（R3）［5］，引物和探针由德国柏林TIB生物公司合成，序列见表1。
标准品的构建
利用TOPO TA Cloning kit（Invitrogen 产品）将rag2和TREC的基因片段克隆到TOPO TA载体上，根据凝胶电泳和分光光度计检测结果，将标准品DNA浓度分别调整为107、106、105、104、103、102、和10/ 2 μl DNA等7组。
bcr?abl的定量检测
引物设计
检测bcr?abl融合基因的引物（B1和B2）和探针（B3）的核苷酸序列参照［6］，可同时扩增b3a2与b2a2两种重排, 其扩增片段长度分别为165 bp和90 bp；选择abl基因作为参照基因，分别在abl基因组序列（ACCESSION X16416）中设计1对引物（A1和A2）及1个荧光素标记探针（A3）［7］，扩增片段长度为124 bp。引物和探针由上海英俊生物技术有限公司合成，序列见表1。
标准品的构建
分别在bcr基因的第13外显子与abl基因的第3外显子设计1个上游引物（C1）和1个下游引物（C2），以K562细胞的cDNA作为模板，进行PCR反应，总反应体积为20 μl，其中含1 μl cDNA，上下游引物0.5 μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，1.0 U Taq聚合酶（Invitrogen产品）和1×PCR缓冲液，反应在PCR扩增仪（MJ, 德国）中进行。共进行35个循环，每一循环包括：94℃ 1分钟（首次4分钟），59℃ 1分钟和72℃ 1分钟（末次10分钟），最后PCR产物保存于4℃中。所扩增出的片段割胶纯化后连接入pMD18?T载体（TaKaRa产品），构建重组质粒，经序列分析证实后，将标准品DNA浓度分别调整为107、106、105、104、103、102、和10 copies/1 μl DNA 7组。该标准品可用于bcr?abl和abl 2个基因的定量检测。
实时定量PCR（real?time quantitative PCR）
TREC 定量分析
每一标本分别进行2次rag2和2次TREC的检测，总反应体系为50 μl，其中含标准品或约100 ng 基因组DNA，引物0.5 μmol/L，0.2 mmol/L dNTP，1.5 U AmpliTaq Gold（Roche公司产品），0.1 μmol/L的6FAM?TAMRA探针和PCR缓冲液（含4 mmol/L MgCl2）。在95℃ 10分钟变性后，共进行45个循环扩增，每一循环包括95℃ 30秒和64℃ 1分钟。反应在ABI PRISM 7000 Sequence Detector（PE公司产品）中进行。反应分别设标准组7个浓度（阳性对照）和阴性对照。
bcr?abl 定量分析
每一标本分别进行2次bcr?abl和abl基因的定量检测，总反应体系为20 μl，其中含标准品或样品cDNA 1 μl，引物0.3 μmol/L，探针0.2 μmol/L，2×Taqman Universit Master Mix 10 μl（PE公司产品），反应条件为50℃ 2分钟, 95℃ 10分钟, 95℃ 15秒, 60℃ 1分钟,共 50个循环。反应在ABI PRISM 7000 Sequence Detector（PE公司产品）中进行。每次反应分别设标准品7个浓度（阳性对照）和阴性对照。
统计学处理
组间比较采用两独立样本t检验，外周血TREC含量与bcr?abl mRNA水平的关系采用Pearson相关性分析，检验水准均为：α＝0.05。
结 果
CML患者外周血TREC的拷贝数分别为0.41±0.51/1 000 PBMNC和2.30±2.26/1 000 CD3+细胞，且不同患者T细胞中TREC拷贝数差别较大（0.03-6.44/1 000 CD3+细胞）。经实时定量PCR检测获得样本中bcr?abl和abl mRNA拷贝数的绝对数值，以bcr?abl/abl表示不同样本中bcr?abl的水平进行比较，15例CML患者初诊时外周血bcr?abl水平的中位数为1.27（0.53-3.34）；6例患者随访2年后bcr?abl水平均有不同程度下降（表2），4例仍处于慢性期的患者，初诊时TREC水平较高的2例（No 1,No 2）的bcr?abl水平下降幅度相对较大，而2例（No 5, No 6）行异基因造血干细胞移植的患者，在监测移植1年后的bcr?abl水平为：No 6连续3次的检测结果均为0，No 5则检测到低水平的bcr?abl融合基因存在。
若将患者以bcr?abl水平高低分为2组，其中1组bcr?abl水平均低于中位数，余患者为另一组，其TREC拷贝数分别为2.80±2.73和1.86±1.85/1 000 CD3+细胞，尽管bcr?abl水平低的1组的TREC水平高于bcr?abl水平高的一组，但差别无统计学意义（P=0.44）。进一步将15例患者bcr?abl水平与T细胞中TREC含量进行Pearson相关性分析，结果显示二者之间无明显的负相关关系（r=-0.10，P=0.71）。
讨 论
CML是一种造血干细胞的恶性克隆性增殖疾病，其分子生物学基础是bcr?abl基因重排，bcr?abl转录本的水平反映了患者体内白血病负荷的情况，定量检测其水平的高低对于判断疾病的预后具有重要意义。TREC是胸腺内T细胞发育早期T细胞受体（T cell receptor，TCR）基因重排过程中删除的环形DNA片段，在所产生的细胞内稳定存在，不随T细胞的进一步增殖而扩增，故随着T细胞的分裂而不断被稀释，其含量代表了TCR基因初始重排形成功能性TCR基因时的幼稚T细胞的数量。以单位数量的细胞中TREC的含量作为胸腺近期输出功能的指标，可真正了解机体T细胞增殖能力的潜能，目前已广泛应用于多种疾病后免疫重建的评价［1，8-10］。还有研究发现，儿童血液系统恶性肿瘤患者TREC水平相对较低者，疾病的预后较差［11］。
本研究首先检测了15例初诊CML?CP患者外周血单个核细胞中TREC的含量，但在白血病患者由于多种因素的影响，不同个体T细胞含量差别很大，只有精确出T细胞中TREC的含量才能进行不同个体和组间的比较。进一步通过CD3+细胞的比例换算出T细胞中TREC的含量。结果显示：CML?CP患者TREC含量明显低于正常人，不同患者差异较大，个别几例患者TREC含量达到或接近正常人的平均水平［5］，但多数含量极低。我们同时检测了该15例患者外周血bcr?abl融合基因的水平，其中位数（1.27）与报道的CML?CP患者的水平接近（1.17）［12］。为了分析CML患者T细胞中TREC含量与其外周血bcr?abl水平的关系，首先将其bcr?abl水平分为高低2组，比较TREC含量，结果发现，尽管bcr?abl水平低的一组的TREC水平高于bcr?abl水平高的一组，但差别无统计学意义（P=0.44）。进一步将患者T细胞中TREC含量与外周血bcr?abl水平进行相关性分析， 未发现明显的相关性 （r=-0.10， P=0.71）。 以上结果提示：初诊CML?CP患者体内T细胞中TREC的含量并不明显影响其外周血bcr?abl融合基因的水平。究其原因一方面可能是定量检测TREC了解到的只是胸腺输出的幼稚T细胞的数量，尽管有研究证实，正常成人产生的幼稚 T细胞具有正常功能，能够针对多种抗原反应［13］，但在疾病状态下，患者内环境紊乱可引起幼稚 T细胞功能缺陷或存活时间缩短，从而使其不能够有效发挥抗白血病效应；另外，患者体内大量白血病细胞极强的增殖能力可能远远超过含量低下的幼稚 T 细胞对白血病细胞的杀伤效应，从而掩盖了由于幼稚T 细胞数量的差别对白血病负荷的影响；而不同年龄患者基础TREC含量的差异可能也是其影响因素之一。
随访监测结果显示：持续处于慢性期的4例患者中，TREC水平较高的2例，bcr?abl下降的幅度相对较大；行造血干细胞移植的2例中，TREC含量相对较低的1例于移植1年后仍可检测到低水平的bcr?abl存在，另外1例则连续3次均未被检测到，而移植1年后仍可检测到bcr?abl存在可能是其预后相对较差的一个因素。本研究中虽然进行追踪检测和移植的病例较少，但其结果也体现了CML患者T 细胞中TREC含量对bcr?abl水平变化的影响，CML患者中胸腺输出功能较高可能对机体抵抗残留CML细胞有一定的帮助，患者预后可能相对较好，初步结果与相关文献报道类似［2，3，11］。若要获得更进一步的结果，如TREC的水平与慢性期的持续时间或移植后存活期的确切关系尚需增加病例数以及更长时间的随访研究。
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