人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进
作者：吴洁莹，廖灿，许遵鹏，陈劲松，辜少玲
【摘要】 本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的方法，为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Percoll分离液（1.073 g/ml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC，应用贴壁筛选法传代培养，流式细胞仪检测细胞表面抗原，成骨诱导体系（地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1 μmol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60 μmol/L）分别诱导MSC定向分化，通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定。 结果表明： 从成人骨髓液中分离培养出MSC，稳定表达CD73、CD105、CD166，不表达CD34、CD45。定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性，脂肪细胞内出现明显的脂滴。结论：采用密度梯度离心联合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化，能够从成人骨髓液中分离出MSC，并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定。本操作方案具有一定的临床应用价值。
【关键词】 间充质干细胞
A modified Method to Isolate and Identify the Adult Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow
Abstract The study was aimed to establish a protocol of isolating and culturing adult mesenchymal stem cells (MSC) from human bone marrow aspirate and identify them by surface antigen analysis and committed differentiation in order to provide an experimental foundation for achieving a therapeutic benefit in applying MSC in hematopoietic stem cell transplantation. MSCs were obtained from fresh human bone marrow aspirate by gradient centrifugation with Percoll (1.073 g/ml) and anchoring culture in L-DMEM with 10% fetal bovine serum by a full medium exchange every 3 days. The MSC surface antigens，including CD34，CD45，CD73，CD105，CD166，were analyzed on FACScan flow cytometer. Under culture in conditioned medium for osteogenesis (the hormone cocktail containing 0.1 μmol/L dexamethasone，10 mmol/L glycerol-2-phosphate and 50 μmol/L ascorbic acid) and adipogenesis (the cocktail containing 1 μmol/L dexamethasone，5 mg/L insulin，0.5 mmol/L 1-methyl-3-isobutylxanthine and 60 μmol/L indomethacin)，MSCs committedly differentiated into osteoblasts and adipocytes. The differentiated mesenchymal stem cells were identified by morphological observation and immunohistochemical staining. The results showed that by gradient centrifugation and adhesion culture，MSCs could be isolated and culture-expanded from human bone marrow aspirate. These cells were uniformly negative for CD34，CD45 and positive for CD73，CD105 and CD166. The osteogenic differentiated cells were positive for alkaline phosphatase (ALP) and the adipogenic differentiated cells displayed accumulation of lipid vacuoles，as detected by oil red O. It is concluded that MSC can be isolated and expand-cultured from adult human bone marrow aspirate and committedly differentiate into osteoblasts and adipocytes. MSC primary identification can be accomplished by flow cytometry and induced differentiation. The set of methods in current experiment shows somewhat practical value for basic research and clinical application.
Key words mesenchymal stem cell; isolation method; identification method; cell culture; committed differentiation
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是最早自骨髓中分离出的一类具有自我更新及多向分化潜能的组织干细胞［1］。作为多种骨髓基质细胞的祖细胞，MSC具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应［2］。MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移植中的干细胞数量相对不足及减少移植物抗宿主病提供了一个有效途径［3，4］。本研究旨在建立一种从成人骨髓组织中分离、培养、扩增MSC的简便易行的方法，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原和定向诱导分化，完成对获得细胞的初步鉴定，为干细胞移植的临床及组织损伤修复工程提供实验基础。
材料和方法
材料与试剂
骨髓穿刺液5 ml取自于健康成人移植供者，肝素抗凝，4℃保存。分离培养试剂：Percoll 细胞分离液（1.073 g/ml，Pharmacia产品），MSC专用培养基MesenCultTM （MSC basal medium and mesenchymal stem cell stimulatory supplements，Stem cell产品）和胎牛血清（FBS，Stem cell产品），低糖及高糖DMEM培养基（Dulbecco′s modified Eagle medium，Gibco BRL产品），胰蛋白酶（Sigma产品）；诱导试剂：地塞米松（dexamethasone）、β-甘油磷酸钠（β-glycerol-2-phosphate disodium salt）、抗坏血酸磷酸盐（ascorbic acid-2-phosphate salt）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰岛素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒均为Sigma产品；流式相关抗体：鼠抗人单克隆抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BD PharMigen产品）、CD105-FITC（SEROTEC产品）。主要仪器：细胞培养板、细胞培养瓶（Corning）；超净工作台（广州医学生物工程研究所，GX-Ⅱ型），细胞培养箱（WTC binder），流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson产品），倒置显微镜、照相机（Olympus），荧光显微镜、数码相机（Nikon），低温冷冻离心机（IEC centra）。
方法
人骨髓MSC的分离培养与传代
无菌条件下用等量PBS稀释肝素抗凝骨髓液，在10 ml消毒离心管中加入6 ml Percoll分离液，再将4 ml稀释的骨髓液小心加至分离液表面，820×g离心20分钟；吸取分界面的白色絮状细胞层，用低糖DMEM培养基混匀，300×g离心10分钟，洗涤2次。按2×105/cm2密度接种于含MSC专用培养基的75 cm2培养瓶，37℃、5% CO2培养箱全湿条件下培养48小时，全量换液，去除血细胞及其它未贴壁成分。用含10％ FBS的低糖DMEM培养基维持培养。根据细胞生长情况，每3天全量换液。细胞融合达80％以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5 ml消化，按1∶4或1∶5传代。取3代以上的细胞进行实验。
MSC表面抗原的检测
取第3代生长达80%融合的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，计数后取2 ×106个细胞，分装6管，每管加入10 μl荧光标记抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另设1管为空白对照，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；加入200 μl PBS混匀细胞，并以1%多聚甲醛固定，4℃保存，24小时内上流式细胞仪检测。
定向诱导MSC向成骨细胞分化的方法与鉴定
收集消化后细胞，按3 000 cells/cm2接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含10％FBS的高糖DMEM培养液，加入成骨诱导体系：地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/L，每3天全量换液，维持2-3周。用碱性磷酸酶试剂盒染色。
定向诱导MSC向脂肪细胞分化的方法与鉴定
收集消化后细胞，按1 ×104 cells/cm2接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含10％ FBS的高糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系：地塞米松1 μmol/L、牛胰岛素5 mg/L（或10 mg/L）、IBMX 0.5 mmol/L、消炎痛60 μmol/L（或200 μmol/L），每3天全量换液，维持2周。镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况，油红O染色。随机选择10个非重复视野，计数脂肪细胞阳性率，结果用均数±标准差（X±D）表示。
结 果
形态学观察
Percoll分离液分离获得的细胞呈圆形，接种48小时全量换液后，可见少量长梭形贴壁细胞，周围有明亮的圆形细胞存在。随着培养时间延长，贴壁细胞迅速增多，呈漩涡状生长，细胞变得细长而有突起，其间散在分布的细小黑色颗粒可能为粘附性强的血细胞，胰蛋白酶消化传代后逐渐消失。原代培养的MSC约15天长满，传代后约5-7天可达80％融合。连续培养12代，细胞生长情况无明显差异，但继续培养至15代，细胞生长速度明显减慢，细胞变大，形状不规则，胞内颗粒增多（图1）。
流式细胞仪表型分析
获得的MSC均质性好，高表达间质细胞标记CD73（98.6％）、CD105（97.7％）、CD166（97.4％），不表达造血细胞标记CD45（0.2％）、CD34（0.4％）（图2）。
ALP染色
加入成骨诱导体系后约1周，可见细胞基质出现结节样钙沉积，至2-3周明显增多，碱性磷酸酶染色强阳性；对照组细胞以未加诱导剂的含10％ FBS的高糖-DMEM培养液培养，染色呈阴性（图3）。
油红染色
加入脂肪诱导体系后约2-3天，个别细胞内就出现微小明亮的脂肪滴，聚集在细胞一侧。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，脂滴明显增大并发生融合，细胞也变成方形或角形，体积变大。培养至2周，融合的脂肪滴几乎充满整个细胞，油红染色呈明亮的橙红色。采用5 mg/L胰岛素和60 μmol/L消炎痛诱导，出现脂滴的时间早于10 mg/L胰岛素和200 μmol/L消炎痛诱导，脂肪细胞阳性率（90.5%±4.5%）大于后者（70.5%±5.5%）（图4）。
讨 论
本研究中从新鲜人骨髓穿刺液中分离获得的骨髓基质细胞具有MSC的一般生物学特性：细胞为典型的成纤维细胞样，呈漩涡状贴壁生长，体外扩增至12代，细胞形态不发生明显改变，高表达间质细胞标记CD73（SH3，4）、CD105（SH2）、CD166，不表达造血细胞标记CD34、CD45。在适宜的诱导条件下，MSC能够较为容易地分化为成骨细胞及脂肪细胞，且具有多向分化能力。由此，建立了从新鲜成人骨髓液分离培养、初步鉴定MSC的实验方案。
MSC在骨髓有核细胞中含量相对稀少，约为1/105［5］，随着年龄增长，骨髓中MSC的数量及增殖分化能力均显著下降［6］。成人骨髓中还存在着造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等多种细胞成分，因此，必须找到合适的分离方法以获得纯度较高且数量较多的细胞产品，以满足临床需要。目前较为常用的方法有：根据MSC低密度特性采用密度梯度离心法；利用MSC与培养底物的粘附性采用贴壁筛选法；根据细胞大小和表面标记采用免疫磁珠或流式细胞分选法。贴壁法直接接种骨髓细胞，在培养过程中不断换液，去除非贴壁细胞，最终得到富集的MSC，但纯度较低；分选法得到的MSC纯度较高，但细胞活率受影响，而且费用昂贵。采用1.073 g/ml Percoll分离液进行密度梯度离心并结合定期全量换液的贴壁筛选法，培养出的MSC纯度提高。细胞接种和传代密度对细胞的生长速度和分化状态有一定影响，尤其是原代培养的人体细胞。本实验采用2×105/cm2的密度接种细胞，48小时全量换液。传代时按照1∶4或1∶5扩增，细胞密度没有严格限制，消化时将0.25％的胰蛋白酶稀释为0.10％-0.15％，并尽量缩短作用时间，减少对细胞的刺激。这样处理的细胞生长良好，多次传代不会影响生物学特性。
体外研究发现，MSC具有多能分化的潜能，经诱导可分化为不同的结缔组织细胞，并把这一现象作为判断MSC自我更新和多向分化能力的指标之一。利用MSC易于分离扩增、表型稳定的生物学特性，可将其作为研究多能干细胞定向分化调控机制的理想模型。已发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员ERK、JNK、p38的特异性抑制剂能够增强脂肪生成转录因子C/EBPα、β及过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR-γ）的表达，促进MSC向脂肪分化，同时抑制成骨分化［7］；骨髓基质祖细胞在向成骨和脂肪细胞分化之间存在某种平衡，ERK可能是体内决定MSC分化方向的开关［8］。本实验联合应用地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、胰岛素、消炎痛、IBMX，诱导人骨髓MSC向成骨细胞及脂肪细胞分化。β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐可为成骨细胞的形成提供磷元素，并促进钙盐沉积；地塞米松激活糖皮质激素受体，促进C/EBPs生成，同时降低脂肪细胞分化抑制因子pref-1的表达； 胰岛素与IGF-1、IRS等受体结合，激活Akt，Ras，ERK1/ERK2等信号传导通路； 消炎痛为非类固醇抗炎剂，是PPAR-γ的配体；IBMX提高细胞内cAMP水平，激活cAMP反应元件结合蛋白（CREB），调控C/EBP(的表达，诱导PPAR-γ和C/EBPα产生，参与脂肪细胞的早期生成［9，10］。结果还显示，低剂量胰岛素和消炎痛诱导MSC分化为脂肪细胞的阳性率更高，提示这两种药物在高浓度时可能存在一定的拮抗效应，胰岛素促进ERK的活化可能导致PPAR-γ磷酸化而降低其转录活性，部分抵消了消炎痛的作用，但该结果有待重复实验加以证实。
骨髓中存在着造血组织和非造血组织两种成分，机体内正常造血功能的维持依赖于造血干细胞的自我更新和造血微环境的完整与稳定。MSC作为多种骨髓基质细胞的前体细胞，参与造血微环境的稳态调控，并为机体新陈代谢及组织损伤修复提供“库存”细胞，在干细胞移植和组织工程中具有广泛的应用前景。本研究初步建立了从成人骨髓穿刺液中获得和鉴定MSC的实验方案，具有操作简单、便于掌握、实验周期较短等特点，适于在临床实验室推广应用，为今后MSC更好地进行临床打下基础。
【】
1Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res，1991; 9: 641-650
2Devine SM，Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Curr Opin Hematol，2000; 7: 358-363
3Maitra B，Szekely E，Gjini K，et al. Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation. Bone Marrow Transplant，2004; 33: 597-604
4Le-Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet，2004; 363(9419): 1439-1441
5Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human Mesenchymal stem cells. Science，1999; 284(5411): 143-147
6Rao MS，Mattson MP. Stem cells and aging: expanding the possibilities. Mech Ageing Dev，2001; 122: 713-734
7Tominaga S，Yamaguchi T，Takahashi S，et al. Negative regulation of adipogenesis from human mesenchymal stem cells by Jun N-terminal kinase. Biochem Biophys Res Commun，2005; 326: 499-504
8Jaiswal RK，Jaiswal N，Bruder SP，et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem，2000; 275: 9645-9652
9Nuttall ME，Gimble JM. Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications. Curr Opin Pharmacol，2004; 4: 290-294
10Rosen ED，Walkey CJ，Puigserver P，et al. Transcriptional regulation of adipogenesis.Genes Dev，2000;14:1293-1307
