细胞芯片的研究进展

             作者：顾军, 刘作易, 张春秀, 唐祖明, 陆祖宏

【关键词】  生物芯片;,细胞芯片;,细胞免疫芯片;,细胞检测

　　[关键词]  生物芯片; 细胞芯片; 细胞免疫芯片; 细胞检测

　　细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术。它是适应后基因组时代人类对生命探索的要求而产生的。作为细胞研究领域的一种新技术, 其既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等, 又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求。本文中扼要介绍细胞芯片的概念以及几种已报道的细胞芯片, 并对细胞免疫芯片进行了简述。

　　1  细胞芯片概念

　　生物芯片技术系指先将大量探针分子固定于支持物上, 然后与标记的样品分子进行杂交, 通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息, 以实现对细胞、 蛋白质、 基因及其他生物组分的准确、 快速、 大信息量的检测。细胞作为生物有机体结构和功能的基本单位, 其生物学功能容量巨大。利用生物芯片技术研究细胞, 在细胞的代谢机制、 细胞内生物电化学信号识别传导机制、 细胞内各种复合组件控制以及细胞内环境的稳定等方面, 都具有其它传统方法无法比拟的优越性。目前, 细胞芯片在国内外已有报道, 一般指的是充分运用显微技术或纳米技术, 利用一系列几何学、 力学、    电磁学等原理, 在芯片上完成对细胞的捕获、 固定、 平衡、 运输、 刺激及培养等精确控制, 并通过微型化的化学分析方法, 实现对细胞样品的高通量、 多参数、 连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等研究目的。新型的细胞芯片应满足以下3个方面的功能: ①在芯片上实现对细胞的精确控制与运输; ②在芯片上完成对细胞的特征化修饰; ③在芯片上实现细胞与内外环境的交流和联系[1]。

　　2  细胞芯片的特点

　　基于细胞芯片的研究分析是一种具有较高通量的技术, 以细胞作为实验平台的细胞芯片至少具有以下3个方面的特点: ①在芯片上实现对活细胞的原位监测, 可以多参数高通量的直接获得与细胞相关的大量功能信息（即关于细胞对各种刺激的应答信息）, 这是细胞芯片最重要的特点; ②通过活细胞分析, 获得细胞相关的分析信息（主要是关于各种刺激物的数量、 质量等相关方面的信息）; ③利用显微技术和纳米技术能精确的控制细胞内的生物化学环境, 以细胞作为化学反应的纳米反应器, 便于详细的研究揭示细胞内一系列过程和原理的本质[1]。

　　3  细胞芯片的分类和应用

　　3.1  整合的微流体细胞芯片(an integrated microfluidic system)  整合的微流体细胞芯片是一种高度平行化、 自动化的集成微型芯片装置, 对细胞样品具有预处理和分析的能力, 又称微全分析系统（integrated micro total analysis system, μTAS）[1]。通过在芯片上构建各种微流路通道体系, 并运用不同的方法在流体通道体系中准确控制细胞的传输、 平衡与定位, 进而实现对细胞样品进行药物刺激等实验过程的原位监测和细胞组分的分析等研究。Larry等[2]在芯片上设计了一种具有三维流动控制概念的装置, 该装置包含一条流体通道和一个中心伸展的V型屏障, 屏障以具有斜坡的一面对应于流体通道。屏障斜坡是细胞平衡、 固定的关键结构, 细胞的平衡、 固定是通过控制流体通道中试剂流体的流动速度、 斜坡对细胞的支持力和细胞向下的重力相互作用完成的。他们在该装置上实现了单个酵母细胞的培养、 去除胞壁、 扫描、 梯度药物浓度刺激和细胞荧光测量等研究。Yang等[3]在芯片上设计了一种并行于流体通道的带有“码头”的“坝”结构, 该流路和“坝”的作用类似于Larry等设计的V型屏障和流路, 通过网状流体通路和“坝”的长短分配药剂流, 产生药剂的浓度梯度。他们选择了Ca2+吸收呈ATP依赖型的HL60细胞作为模型, 检测了诱导显著的细胞内Ca2+信号行为的ATP浓度阈值, 利用细胞芯片原位监测细胞对系列药物浓度梯度刺激的胞内应答行为。瑞典兰德大学神经生院的Davidsson等[4]选用HeLa细胞作为模式细胞, 在芯片上监测细胞内已报道的基因活性并检测了这些基因表达的条件, 以减少基因的不确定表达。Munce等[5]在芯片上进行了单细胞毛细管电泳分离, 他们在芯片上构建多重并联的毛细管通道, 以满足高通量分析和避免分离样品交叉污染的需求。此外, 还有在芯片上同时构建流路和分离、 排列、 定位细胞所需空间的微孔或沟槽等结构的芯片类型, 用于细胞的多参数检测筛选。整合的微流体细胞芯片制作方法多样, 类型不一, 较快, 应用的范围也比较广泛, 内容涉及细胞的固定培养、 鉴定筛选、 分化刺激、 原位检测、 药物开发筛选和组分分析等各个方面。

　　3.2  微量电穿孔细胞芯片(microelectroporation cell chip)  当给细胞一定的阈电压时, 细胞膜具有短暂的强渗透性。利用细胞膜的这种特性将外源DNA、 RNA、 蛋白质、 多肽、 氨基酸和药物试剂等精确的转导入靶细胞的技术称为电穿孔技术。该技术能直接应用于基因。微量电穿孔细胞芯片正是将这种技术与生物芯片技术相结合的产物, 是细胞操作调控微型化的一种手段。该技术采用一种微型装置, 将细胞与芯片上的集成电路相结合, 利用细胞膜微孔的渗透性, 通过控制电子集成电路使细胞面临一定的电压, 电压使细胞膜微孔张开, 从而在不影响周围细胞的情况下可将外源DNA, RNA、 蛋白质、 多肽、 氨基酸和药物试剂等生物大分子或制剂等顺利的导入或从靶细胞中提取出来, 并进行后续研究。这种技术为研究细胞间遗传物质的转导、 变异、 表达以及控制细胞内化学反应提供了可能。最先进行这种单细胞电穿孔尝试的是Huang和Rubinsky[6]的科研小组, 他们最终找到了一种利用电穿孔细胞芯片控制人体细胞活动的方法。Shin等[7]运用聚二甲基硅氧烷等材料构建了电穿孔细胞芯片, 他们在芯片上构建一条长2 cm高20 μm的流体通道, 通过指数衰变式脉冲发生器对通道内的细胞进行电穿孔实验, 测量了细胞电穿孔时各种参数, 原位观察了碘化丙啶被SKOV3细胞株吸收的全过程, 并成功的将绿色荧光标志的蛋白基因转染了SKOV3细胞, 监测了活细胞内DNA逆传的。需要指出的是, Shin等制作的芯片也是通过流体通路来实现对细胞的控制的。此外, 也可以采用纳米针和纳米管等显微操作穿刺细胞膜, 并在芯片上构建纳米通道, 完成向单细胞注射或提取所需样品。

　　3.3 细胞免疫芯片(cell immunochip)  细胞免疫芯片是一种新型的细胞芯片技术, 是在蛋白质芯片的基础上起来的。它是以细胞为研究对象, 利用免疫学原理和微型化操作方法, 实现对细胞样品的快速检测和分析。它的免疫学基础是抗原或抗体的固相化、 抗原抗体特异性反应及抗原或抗体的检测方法（如荧光标记、 酶标记及放射标记等）。在芯片上固定的抗体或抗原必须保持原有的免疫学活性, 在测定时, 受检标本（测定一般为细胞表面的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体进行反应, 通过免疫学特异性反应捕获目标细胞,然后根据标记与否以及标记物的不同选择不同的检测方法, 快速完成对细胞的检测, 并且可以对细胞进行免疫化学测定等后续研究[8, 9]。它是一种应用范围广、 实用性强的生物芯片技术。

　　3.3.1  细胞免疫芯片的原理  根据捕获细胞的检测要求将不同的抗原或抗体以较高密度固定在经过修饰的玻片等载体上并保持其活性不变, 形成抗原或抗体微阵列, 然后利用细胞表面抗原与抗体等免疫学特异性反应原理, 通过抗原或抗体微阵列和细胞悬液样品的反应捕获待测目的细胞, 将未结合在芯片上的细胞和非特异性结合的细胞从芯片上洗脱, 则靶向细胞将结合在微阵列的不同抗体或抗原点上。结合在不同抗体或抗原点上的细胞代表了不同的细胞免疫表型, 从而完成对细胞分离、 分类及检测目的, 或者继续对细胞样品进行标记和其他方面的后续研究[8, 9]。

　　3.3.2  细胞免疫芯片的特点  目前, 细胞免疫芯片主要应用于细胞的检测, 与其它的细胞检测方式相比, 它具有以下几个特点: ①利用抗体和细胞表面抗原的特异性反应原理, 检测表达特异性表面抗原的细胞, 具有较高的特异性; ②由于芯片的密度较高, 获得的信息量较大, 可以高通量、 高平行性的综合检测、 分析细胞样品, 一次可以检测同一或不同样品细胞的多种表达抗原; ③适用范围广, 凡是可以制成细胞悬液的样品均可进行检测; ④操作简便灵活, 染色、 标记等步骤可根据实验要求增加或删减, 经济方便, 无须价格昂贵的检测设备, 普通显微镜即可检测, 经济实用。

　　3.3.3  细胞免疫芯片的制作  细胞免疫芯片的制备主要以玻片为基底, 通过对玻片表面进行化学修饰, 以使生物分子固定后仍保持原有的生物活性。玻片表面的化学修饰有多种方式, 三维修饰如琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等修饰; 二维修饰如醛基、 氨基等修饰。琼脂糖修饰由于具有操作简便、 对生物分子的固定能力较强而应用较多。将所需要的抗体或抗原样品按一定的排布方式点样到经过修饰的玻片上,  形成微阵列芯片。被检测细胞悬液（荧光标记或非标记）在微阵列芯片上进行孵育结合后洗去未结合的细胞, 则被检测细胞被捕获于芯片表面。可以直接在芯片上检测, 也可以将目标细胞洗脱后培养进行间接检测。直接检测快捷简单, 对于荧光标记的细胞免疫芯片, 用激光扫描细胞仪进行扫描, 然后通过机分析出每个点的平均荧光强度。对于酶标记的细胞免疫芯片, 只须显色后将检测细胞放在光镜下观察, 用CCD照相机进行拍摄记录结果即可, 将信号通过计算机处理得到每个点的灰度。间接检测根据对样品的要求不同而采用不同的方法。

　　3.3.4  细胞免疫芯片的应用  细胞免疫工程包含生物医药学方面研究基因组序列功能和病相关的核心技术与内容。细胞免疫芯片为分子医药学发展靶向免疫诊断、 肿瘤和其他细胞表面抗原相关疾病提供了一种新型研究方法。由于细胞免疫芯片对生物样品的要求较低, 使得样品的预处理大为简化, 因此, 应用范围广泛, 凡是可以制成细胞悬液的样品都可以进行检测, 如淋巴细胞悬液、 其它细胞或组织等生物样品等。Zhang等[8]利用红细胞为材料研究了细胞免疫芯片在细胞检测方面的初步应用, 他们将抗体固定在琼脂糖修饰的玻片上, 并通过固定的抗体与细胞表面的抗原反应捕获细胞。Belov等[9]根据不同的白血病在白细胞质膜上分化抗原(CD)组表达的差异, 进行了白血病免疫分型实验。他们运用较高密度的抗体微阵列, 在一次测定中可以快速的检测50种或更多的白细胞或白血病细胞的分化抗原(CD), 他们分别从正常的外周血白细胞、 慢性白血病细胞、 多毛白细胞、 上皮淋巴细胞、 急性淋巴白细胞、 T细胞介导的急性淋巴白血病细胞等样品中获得了清楚且重复性好的结果, 并验证了48种分化抗原（CD）在芯片上和流式细胞仪上分析结果的吻合性, 在白血病的辅助诊断和预后判断等方面都提供了充足的理论依据, 显示了细胞免疫芯片应用在白血病免疫诊断及预后判定方面的诱人前景。基于类似的原理, Revzin等[10]运用光刻胶技术在玻片上构建了聚乙二醇水凝胶壁组成的规格分别为20 μm×20 μm与15 μm×15  μm的微孔, 并将微孔内的玻片根据不同的需求进行修饰, 选择性地结合淋巴细胞特异性抗体或其他细胞黏附因子, 从而形成高密度抗体或细胞因子芯片, 该芯片的突出优点是不仅可以根据细胞表面抗原抗体分化信息对白细胞进行免疫分型, 而且可以运用激光捕获微切割技术在芯片上有选择地对细胞内的基因和蛋白质组进行分析检测。细胞免疫芯片在新药物的开发筛选等方面亦将提供强有力的技术支持。如筛选新药物时, 利用芯片上的靶细胞筛选和其作用的新药物, 或者根据细胞表面特定抗原的是否表达, 通过芯片上的抗体微阵列来筛选经过不同新药物处理过的细胞, 不仅可以提高药物开发的效率, 而且实现了药物筛选的敏感性、 高通量和自动化的集成。

　　4  展望

　　细胞芯片是近年来发展起来的一种检测细胞的新技术, 它是对基因芯片和蛋白质芯片技术的重要补充。随着生物芯片技术和生物信息学的不断进展, 细胞芯片的制作技术将越来越成熟。细胞芯片技术通过应用免疫细胞化学、 原位分子杂交等原理对细胞基因、 蛋白表达水平进行定位检测等研究,    已经在基因检测、 基因表达、 组分多态性分析、 药物开发筛选和疾病诊断等诸多领域显示出重要的作用,  在白血病等肿瘤的辅助诊断和预后判断方面也有着重要的应用价值。可以预见, 细胞芯片技术作为一种新兴的生命领域中细胞水平的研究手段和传统的研究细胞的方法相结合, 将广泛的应用于生命科学研究及其实践的各个领域。

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