缬沙坦和美托洛尔对心肌梗死后大鼠钾通道Kv9.X基因表达的不同影响

【关键词】  美托洛尔

        ［摘要］  目的  研究缬沙坦和美托洛尔对心肌梗死后大鼠心室肌钾通道Kv9.X（Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3）表达的影响。

    方法  通过结扎大鼠左前降支近端建立心肌梗死大鼠模型，手术后存活大鼠随机分入心肌梗死（MI）组（7天、30天）、缬沙坦（Vas）组（7天、30天；缬沙坦30 mg/kg,每日1次）和美托洛尔（Meto）组［7天、30天；美托洛尔8 mg/（kg・d），每日2次］，同时设立相应假手术（SH）组。应用半定量RT-PCR方法检测左室心肌（梗死者取非梗死心肌）钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA量。

    结果  Meto组：与SH组比较，Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量下降（均为P<0.05）；与MI组比较，30天时Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量明显升高（P<0.05），7天时差异无显著性；与Vas组比较，Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量明显减少（均为P<0.05）。Vas组：与SH组比较，Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量差异无显著性；与MI组比较，Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量（30天，7天）均显著升高（分别为P<0.01，P<0.05）；Vas组内比较差异无显著性。

    结论  缬沙坦和美托洛尔都可以逆转钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3基因表达的下调；缬沙坦比美托洛尔更有效且迅速。

    ［关键词］  心肌梗死；钾通道；Kv9.X；缬沙坦；美托洛尔

       Different effects of valsartan and metoprolol on expression of potassium channels Kv9.X in rat ventricular myocardiums after myocardial infarction

      ［Abstract］  Objective  To study the effects of valsartan and metoprolol on expression of potassium channels Kv9.X（Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3） in postMI rat heart.

    Methods  Using a rat model of MI,induced by the left anterior descending coronary artery （LAD） ligation in female SpragueDawley rats,the living rats were randomly divided into postMI group ［7days（n=10）; 30days（n=11）］,valsartan group ［7days（n=10）;30days（n=10）,valsartan 30 mg／（kg・day）］ and metoprolol group［7days（n=10）;30days（n=9）,metoprolol 8 mg／（kg・day）］.Accordingly,the shamoperation group （shamgroup）was established. Using semiquantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction（RTPCR）,we measured Kv9.1,Kv9.2，Kv9.3 mRNA in each group.

    Results  Metoprolol groups:Compared to the shamgroups,Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA reduces （P<0.05）; Compared to MI groups,Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA in the 30 days group remarkably increases （P<0.05） whereas there is no difference in the 7 days group; Compared to valsartan groups,Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA remarkably reduces （P<0.05）. Within the metoprolol groups,there is no difference between two groups. Valsartan groups:Compared to the shamgroups,there is no difference between two groups; Compared to MI groups,the expression of Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA in the 30 days group or 7 days group remarkably increases （P<0.01,P<0.05,respectively）.There is no difference between two valsartan groups.

    Conclusion  Both of valsartan and metoprolol may reverse the downregulation of the expressions of potassium channels Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA; In contrast to metoprolol,valsartan can reverse the downregulation of expression of Kv9.1，Kv9.2，Kv9.3 mRNA more effectively.

    ［Key words］  myocardial infarction;potassium channels;Kv9.X; valsartan;metoprolol

    钾通道在调控心肌细胞电生理功能稳定方面起着非常重要的作用［1］。延迟整流钾电流（Ik）是心肌细胞的主要复极离子流，主要在复极2期和3期起作用，包括3种成分Ikr、Iks、Ikur。心肌梗死后Ik电流的振幅减低和电生理特性改变，即Ikr的激活和Iks的失活加速［2］，Kv9.X（Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3）属于静默型钾通道，主要和钾通道Kv2.－α亚单位结合形成异四聚体，来调控Ik电流的电生理特性，与单纯由Kv2.1形成的通道相比，其激活、失活和复活的特性均明显不同［3，4］。心肌梗死时肾上腺素系统和肾素－血管紧张素系统激活。但目前，关于心肌梗死后钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3的改变和药物的影响还没有报道。因此，本实验通过建立大鼠心肌梗死模型，来研究β1受体阻滞剂美托洛尔和Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂缬沙坦对心肌梗死后钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3基因表达变化的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物模型的建立  选用年龄、体重相近的成年SpragueDawley（SD）雌性大鼠（200～250 g，均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，清洁级）。左侧开胸术，打开心包，用5-0丝线在左心耳下1～2 mm处结扎左前降支近端。成功的阻断通过立即发生的心电图ST段抬高确定。假手术组也重复上述步骤，唯一的区别是不结扎冠脉。取结扎后存活大鼠，分入MI组［7天组（n=10）;30天组（n=11）］、缬沙坦组［7天组（n=10）;30天组（n=10）］、美托洛尔组［7天组（n=10）;30天组（n=9）］。建立假手术组［7天组（n=10）;30天组（n=11）］。所有大鼠均接受相同的饲养条件。

    1.2  方法

    1.2.1  给药方法  缬沙坦组大鼠于术后4～12 h给予缬沙坦（上海诺华制药有限公司，批号：990811）30 mg/kg灌胃至术后相应时间；美托洛尔组大鼠于术后4～12 h给予美托洛尔［阿斯利康（江苏）制药有限公司，批号：200209001］8 mg/kg灌胃至术后相应时间。MI组和假手术组大鼠于术后4～12 h给予生理盐水（2 ml/d）灌胃至术后相应时间。

    1.2.2  心肌组织标本的留取  于术后第7天和第30天在20％乌拉坦麻醉下，迅速取出心脏，置于4 ℃预冷的生理盐水漂洗除去血液。小心去除右心室和心耳，留取左心室肌（MI大鼠取非梗死区心肌），剪碎后放入液氮中保存。

    1.2.3  心肌总RNA的提取和Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3mRNA检测  取50～100 mg大鼠心肌，应用TRIZOL匀浆、提取组织总RNA，紫外线检测样品吸光度，A260／A280为1.95～2.10。应用RTPCR法（通用RTPCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司）检测mRNA的表达，94 ℃预变性5 min，PCR扩增30～32个循环（94 ℃变性45 s，退火45 s，72 ℃延伸45 s）后，72 ℃再延伸10 min，然后4 ℃ 5 min。1.5％琼脂糖电泳分析PCR产物，于紫外线下应用DNA凝胶成像系统观察、记录结果，用光密度扫描Kv9.1～Kv9.3／βactin。各目的基因及βactin引物序列、片段长度、退火温度、循环数，见表1。表1  各目的基因及βactin引物序列、片段长度、退火温度、循环数   

　　 1.3  统计学方法  计量数据以（x±s）表示,分别采用方差分析、成组资料的t检验，两两比较用StudentNewmanKeuls检验。P<0.05为差异有显著性；P<0.01为差异有非常显著性。

    2  结果

    2.1  大鼠心肌Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达变化  美托洛尔组：与假手术组比较，30天组和7天组Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量均明显降低（均为P<0.05）；与心肌梗死组比较，30天组Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量明显升高（P<0.05）。与缬沙坦组比较Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量明显减低（均为P<0.05）。缬沙坦组：与假手术组比较，30天组和7天组Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量差异无显著性；与心肌梗死组比较，30天组和7天组Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3 mRNA表达量均显著升高（分别为P<0.01、P<0.05）。见表2～4。

    2.2  各组大鼠心肌Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3扩增产物电泳图  见图1。表2  各组大鼠心肌Kv9.1 mRNA表达的变化注：缬沙坦组与心肌梗死组比较，■P<0.05，*P<0.01；美托洛尔组与假手术组比较，▲P<0.05；美托洛尔组与缬沙坦组比较，◆P<0.05；美托洛尔组与心肌梗死组比较，★P<0.05 表3  各组大鼠心肌Kv9.2 mRNA表达 的变化注：缬沙坦组与心肌梗死组比较，■P<0.05，*P<0.01；美托洛尔组与假手术组比较，▲P<0.05；美托洛尔组与缬沙坦组比较，◆P<0.05；美托洛尔组与心肌梗死组比较，★P<0.05表4  各组大鼠心肌Kv9.3 mRNA表达的变化注：缬沙坦组与心肌梗死组比较，■P<0.05，*P<0.01；美托洛尔组与假手术组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；美托洛尔组与心肌梗死组比较，★P<0.05；美托洛尔组与缬沙坦组比较，◆P<0.05

    图1  7天（A：Meto组；B：Vas组；C：MI组；D：SH组）；M：Marker（上至下：250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp）；30天（E：SH组；F：MI组；G：Vas组；H：Meto组）

    3  讨论

    本实验发现：（1）美托洛尔和缬沙坦均可逆转钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3表达的下调；（2）美托洛尔的逆转作用比较缓慢；缬沙坦的逆转作用则完全迅速，相比来说，缬沙坦更有效。

    心肌梗死时发生肾上腺素系统和肾素－血管紧张素系统的激活。它们是调控机体功能应激的两个主要的信号转导系统。肾上腺素信号在调控心脏功能方面起着基础性作用。在心脏儿茶酚胺对β－肾上腺素能受体刺激被认为是对应激发生反应时增强心脏功能的最强有力的调控机制，这是通过激活经典的由G蛋白Gs，腺苷酸环化酶，cAMP和蛋白激酶A（PKA）组成的刺激通路实现的［5］。蛋白激酶C（PKC）是细胞功能的一个关键调制子，它是AngⅡ（血管紧张素Ⅱ）作用的主要靶点之一［6］。AngⅡ与其Ⅰ型受体相偶联，通过百日咳毒素非敏感G蛋白（Gq/11）激活磷脂酶C（PLC），PLC水解膜磷酸肌醇而生成甘油二酯（DAG），后者激活PKC［6，7］，从而发挥调控作用。

    延迟整流钾电流（Ik）是心肌细胞电活动中主要的离子流之一，主要在心肌复极2期和3期起作用。心肌梗死后Ik电流的振幅减低和电生理特性改变，即Ikr的激活和Iks的失活加速［2］，Kv9.X（Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3）属于静默型钾通道，是近年来新发现的调控性钾通道，主要和钾通道Kv2.－α亚单位结合形成异四聚体，来调控Ik电流的电生理特性，与单纯由Kv2.1形成的通道所形成的Ik相比，其激活、失活和复活的特性均明显不同［3，4］。因此，它们的改变可能引起Ik电流的电生理特性的变化，造成心肌细胞电生理不稳定，从而促成心律失常的发生。

    蛋白激酶PKA和蛋白激酶PKC是机体正常生理功能和应激时的主要调控子。研究显示，PKA能够引起Ik电流的增强［8，9］，而蛋白激酶PKC则引起Ik电流的减低［10，11］。美托洛尔的长期可以改善儿茶酚胺长期激活时肾上腺素系统对其敏感性的下降和β受体的密度减低［12］。因此，我们实验发现美托洛尔可以逆转钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3表达的下调，这可能是美托洛尔增强PKA而起作用的结果，但由于美托洛尔导致肾上腺素系统的改善是一个缓慢的过程，这或许可以解释我们发现美托洛尔逆转钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3表达的下调比较缓慢的原因。血管紧张素Ⅱ是肾素－血管紧张素系统的最主要血管活性肽。Hakabuchi等［13］研究发现，血管紧张素Ⅱ可通过激活PKC和阻滞PKA来压抑Ik电流和改变其动力学。因此，缬沙坦可通过阻滞Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体，进而改善PKC和PKA这两个蛋白激酶而逆转钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3表达的下调，因而其逆转作用也就完全且迅速。

    总之，本研究首次报道了心肌梗死后钾通道Kv9.1、Kv9.2、Kv9.3表达的变化及β1受体阻滞剂美托洛尔和Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂缬沙坦对其表达变化的不同影响。这至少能够提示：（1）心肌梗死时将其他抗心律失常药物与Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂合用可能会提高其抗心律失常的效果；（2）心肌梗死时单独应用Ⅰ型血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂或可以减少恶性心律失常的发生。而这两点需要进一步的实验研究和（或）临床研究来验证。

    ［］

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