姜黄素对S180小鼠体内抗肿瘤作用的实验研究
作者：赵东利，谢小卫，李明众，王书文
【关键词】 姜黄素；S180小鼠；抗肿瘤
摘要：目的 研究姜黄素对小鼠移植性肿瘤S180的生长抑制作用，并探讨其可能的作用机制。方法 30只S180小鼠随机分为生理盐水组(空白对照组)、环磷酰胺组(阳性对照组)及姜黄素组。观察：①各组抑瘤率；②各组小鼠胸腺及脾脏指数；③光镜下各组小鼠瘤细胞生长及病理形态变化情况；④各组凋亡细胞积分及凋亡细胞形态。结果 ①姜黄素组的抑瘤率为68.32%，阳性对照组的抑瘤率为70.43%，与空白对照组比较，两组的抑瘤率均明显升高(P<0.01)。②姜黄素组小鼠的胸腺指数与空白对照组比较无明显降低(P>0.05)，但阳性对照组与其他两组比较明显降低(P<0.05)；三组小鼠脾脏指数无显著性差异(P>0.05)。③光镜下姜黄素组和阳性对照组瘤细胞生长、浸润程度、核分裂、血管数目较空白对照组明显减少(P<0.05)，而坏死程度、脾小体数及巨核细胞数较空白对照组明显增多(P<0.05)。④甲基绿派洛宁染色结果显示姜黄素组的凋亡细胞积分明显高于其他两组(P<0.05)；电镜观察姜黄素组瘤细胞较其他两组异染色质增多，核膜不完整，线粒体肿胀，核染色质溶解，有的形成凋亡小体。结论 体内动物实验及形态学观察表明姜黄素能有效抑制体内S180小鼠肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡，而对于免疫器官胸腺则无影响。
关键词：姜黄素；S180小鼠；抗肿瘤
Experimental study on the anticancer effect of Curcumine on mice of S180 in vivo
ABSTRACT: Objective To study Curcumines growthinhibitory effects and morphological changes on sarcoma grafts of S180 mice, with further inquiry into the possible mechanism. Methods A total of 30 cases of S180 mice were assigned randomly into 3 groups: saline group (blank control), CTX group (positive controlled ) and Curcumine group. ① The antitumor effect on internal organ of mice was observed to study the tumor inhibition rate in different groups. ② Influence of curcumine on mices immune system was studied by comparing the index of thymus and spleen. ③ The growth and pathomorphologic changes of tumor cells were observed. ④To calculate the index of apoptosis cells and observe the morphological changes of all groups apoptosis cells under electroscope. Results ① The inhibitory rate was 68.32% in the curcumine group, 70.43% in the positive controlled group. Compared to blank control group, these two groups had significantly elevated tumor inhibition rate (P<0.01). ② Thymus index in curcumin group did not have significant decrease compared to that in negative control group (P>0.05); however, positive thymus index in control group had significant decrease compared with that in the other two groups (P<0.05). There was no significant difference of spleen index in all experimental groups (P>0.05). ③ Under electroscope, curcumine group and positive control group had significant decrease in growth of tumor, degree of tumor infiltration, number of nucleus fission, and blood vessel number compared to those in negative control group (P<0.05). However, degree of cell necrosis and the number of splenic segments, and macrophage increased significantly compared to those in blank control group. ④ Accumulative score in curcumine group, with Methyl greenpyronine staining dye, was significantly higher than in other two groups (P<0.05) and sarcoma cells in curcumin group had more abnormal chromosomes, inconsistency of nuclear membranes, unclear or disappeared cell organ structure, swelling of plastosome, dissolved chromatin, and withered small body. Conclusion Internal organ study and cell morphology observation show that curcumine can effectively inhibit the growth and cause the death of sarcoma grafts of S180 mice without interference with thymus.
KEY WORDS:curcumin; mice of S180; anticancer
肿瘤是严重危害人类身心健康的常见疾病，应用化学药物肿瘤是目前临床上采用的重要手段之一。 近年来从天然植物中提取抗肿瘤药物已日益引起人们的重视。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种酚性色素，具有广泛的药理作用，对多种肿瘤具有明显的抑制作用。本课题着重应用病实验技术和方法，对小鼠移植性肿瘤――肉瘤180(S180)进行体内抗肿瘤实验，通过观察其抑瘤率及病理形态学变化，从整体及细胞学角度探讨姜黄素的抗肿瘤作用。
1 材料与方法
1.1 材料 小鼠移植性肿瘤S180，购自第四军医大学病理学教研室；清洁级雄鼠，体重18-22g，由第四军医大学动物中心购入；姜黄素(分子式C21H20O6，相对分子质量368.4，纯度99%)购自山东省医学院药物所；环磷酰胺,由山东齐鲁制药厂提供；甲基绿派诺宁染色试剂，由西安大学医学院人体解剖与组织胚胎学系配制。
1.2 方法
1.2.1 抗肿瘤实验 采取体内抗肿瘤实验法[1]。
1.2.2 S180带瘤动物的移植和接种 取传代接种后9-10d之瘤源小鼠，无菌条件下从腹腔抽出瘤液,用灭菌生理盐水调整瘤细胞数至5×106/mL，每鼠右腋皮下接种0.2mL。
1.2.3 实验方法 将接种了S180的小鼠随机分为姜黄素组(治疗组)、阳性对照组(环磷酰胺组)和空白对照组(生理盐水组)。接种次日同时灌胃给药，给药量0.2mL，每日给药一次，连续10d。停药次日断椎处死，称体重，解剖剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式抑瘤率：抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%；同时剖取胸腺和脾脏，称其重量，按下式计算胸腺、脾脏指数：脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)重量(mg)/体重(g)。
1.2.4 光镜观察 取各组S180小鼠的瘤体，用10%(体积分数)甲醛溶液固定，取材，常规石蜡包埋切片，HE染色。普通光学显微镜下分别观察以下指标。①瘤细胞生长情况，共分四级：瘤细胞量少，稀疏为+；瘤细胞成片，较密集为；瘤细胞成片密集为；瘤细胞大片密集，坏死少，为；分别计1-4分；②瘤组织浸润程度，共分四级。皮下结节，无浸润为+；侵及脂肪为；侵及脂肪、肌肉为；侵及脂肪、肌肉、神经并穿入胸腔为；分别计1-4分；③核分裂数：每张片观察5个高倍(×400)视野，记录核分裂数；④血管数目：每张片观察3个中倍(×200)视野，记录瘤实质中血管总数；⑤坏死程度。分四级，少量坏死+；小灶状坏死；片状坏死；坏死并出血，计1-4分；⑥脾脏。每张片计数中倍(×200)视野脾小体个数及巨核细胞数。
1.2.5 甲基绿派洛宁染色[2] 分别将甲基绿和派洛宁配成20g/L(2%)的水溶液，充分溶解后分别置入250mL分液漏斗中，分别加等量的氯仿充分混合，静置分层，使下层的着色氯仿流去。甲基绿抽提6次，派洛宁抽提4次，然后分别放入200mL的试剂瓶中，加等量氯仿。进行常规染色。结果判定：DNA呈蓝绿色 ，RNA呈红色，背景无色。
1.2.6 显微镜观察 常规电镜程序制备切片，电镜下观察各组肿瘤细胞的形态。
1.2.7 统计学处理 所有实验数据采用SPSS10.0 统计软件分析处理。数据以±s表示，组内和组间比较采用方差分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 姜黄素对S180小鼠的抑瘤作用 姜黄素组的抑瘤率为68.32%，阳性对照组的抑瘤率为70.43%，与空白对照组比较，两组的抑瘤率均明显增高，差异有显著性(P<0.01，表1)。
表1 姜黄素对S180小鼠的抑瘤作用（略）
Table 1 Tumor inhibition rate of Curcumine on mice of S180
*P<0.01 vs. blank
2.2 姜黄素对小鼠免疫器官的影响 姜黄素组小鼠的胸腺指数与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05)，但阳性对照组与其他两组比较均有显著性差异(P<0.05)；三组小鼠脾脏指数无显著性差异(P>0.05，表2)。
表2 姜黄素对S180小鼠的脾脏、胸腺器官的影响（略）
Table 2 Effect of Curcumine on immune organ of mice of S180
*P<0.05 vs. blank and Curcumine group
2.3 瘤组织病理形态学观察积分情况 空白对照组瘤细胞生长旺盛，细胞较密集或呈大片状，核分裂数多，浸润较深，至脂肪、肌层、胸管及食管等处，血管较丰富，坏死范围较小。姜黄素组及阳性对照组上述各指标程度较轻，而坏死较严重，且有大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01，表3，图1)。
2.4 凋亡细胞积分 用甲基绿－派洛宁染色观察各组凋亡细胞数，每张切片任选3个视野，计算凋亡细胞数。结果可以看出各组均有凋亡细胞，但姜黄素组更为明显，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.01，表4，图2)。
2.5 电镜观察结果 空白对照组瘤细胞结构清晰，核不规则，异染色质丰富，细胞器多，溶酶体、线粒体均可见，细胞表面有微绒毛突起；阳性对照组瘤细胞结构欠清晰，核染色质稀少，有的有双核仁，部分可见核染色质凝聚成块并边集，细胞器减少或消失，有的核异型， 染色质边集；而姜黄素组瘤细胞异染色质增多，边聚，核膜不完整，有裂隙，有的形成凋亡小体，细胞器结构不清或消失，有的线粒体肿胀、嵴模糊或消失，有的核染色质溶解，内质网肿胀(图3)。
图1 光镜下3组瘤细胞的病理形态学的变化（略）
Fig.1 Pathomorphological changes of tumor cells under optical microscope (HE×200)
A: blank control; B: positive control; C: curcumine group
图2 3组甲基绿派洛宁染色的病理形态学的变化（略）
Fig.2 Pathomorphological changes of tumor cells dyed with Unna staining (×400)
A: blank control; B: positive control; C: curcumine group
图3 电镜下3组瘤细胞的病理形态学变化（略）
Fig.3 Pathomorphological changes of tumor cells under electron microscope
A: blank control; B: positive control; C: curcumine group
表3 各组瘤细胞病理形态学观察的积分结果（略）
Table 3 Effect on pathologymorphology of tumor cells
*P<0.05,**P<0.01 vs. blank
表4 甲基绿派洛宁染色镜检凋亡细胞积分结果（略）
Table 4 Methyl greenpyronine staining dye used to calculate the index of apoptosis cells
*P<0.05,**P<0.01 vs. blank
3 讨论
姜黄素是从姜科植物的根茎姜黄中提取的一种植物多酚，具有抗诱变、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等广泛的药理作用[3]，其中抗肿瘤是其主要活性。姜黄素对多种恶性肿瘤的生长起抑制作用。Han等[4]将不同浓度的姜黄素与小鼠B细胞淋巴瘤细胞BKS2和WEHI231共培养48h，结果发现姜黄素以时间和浓度依赖性的方式抑制淋巴瘤细胞的增生。Ushida[5]的研究表明，姜黄素可抑制化学诱癌剂所诱发的动物皮肤癌、胃癌、结肠癌、十二指肠癌、食管癌、乳腺癌的发生，并在体外对食管癌、胃癌、结肠癌细胞等均具有直接杀伤作用。Limtrakul等[6]用DMBA诱导，然后用TPA促进小鼠皮肤癌的生成，在饲喂含有1%姜黄素的饲料后可明显减少肿瘤数量，缩小瘤体积。薛妍[7]报道姜黄素对SMMC7721细胞有显著的生长抑制作用，并呈剂量依赖性。本实验通过给各组小鼠灌胃，结果发现阳性对照组和姜黄素组具有较高的抑瘤率，阳性对照组为70.43%，姜黄素组为68.32%，两者之间没有明显差异，但和空白对照组比较两组的抑瘤率均明显增高，证实姜黄素具有明显的抗肿瘤作用。病理形态学的变化即光镜及电镜结果更加证实了姜黄素的作用并提供其作用的可能机理。光镜下可以看出空白对照组瘤细胞生长旺盛、细胞较密集或呈大片状，核分裂数多，浸润较深，至脂肪、肌层、胸管及食管等处，血管较丰富，坏死范围较小。姜黄素组及环磷酰胺组上述各指标程度较轻，而坏死较严重，且有大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，与空白对照组比较有显著性差异。姜黄素组对瘤细胞的生长浸润及血管数目抑制作用更明显，说明姜黄素在直接杀伤肿瘤瘤细胞的同时，影响肿瘤的血管生成，使其供血减少而导致瘤细胞坏死。此方面与报道一致。血管生成是肿瘤组织迅速增殖和转移扩散的重要条件之一。Arbiser等[8]研究了姜黄素在体内和体外的抗血管形成的作用，结果发现，姜黄素可有效抑制由碱性成纤维生长因子(BFGF)诱导的小鼠角膜新生血管的生成，并明显抑制小鼠BFGF的表达。所以，他认为姜黄素对肿瘤的预防作用在一定程度上是通过抑制血管生成实现的。邵志敏等[9]研究也表明，姜黄素可抑制MDAMB231人类乳腺癌细胞的两种主要的生长因子VEGF和BFGF的转录水平，从而减少肿瘤细胞的血管生成。姜黄素除了具有明显的抗肿瘤活性外，在糖尿病的上也有很好的作用。崔冰等[10]的研究提示，姜黄素能抑制高糖诱导的MCS增殖，并下调FN蛋白表达。因此，姜黄素可能通过阻抑FN表达减少细胞外基质积聚，从而发挥对糖尿病肾脏的保护作用。大量数据表明，体内肿瘤的发生是由于机体脱离了体内稳态的调控机制。而这一调控机制是通过细胞凋亡来实现的。目前，肿瘤的主要治疗方法放射治疗和化学治疗，均主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而显示其疗效。孙春艳[11]的研究认为姜黄素可有效抑制Raji细胞的增殖，其机制可能为调控细胞周期进程而诱导肿瘤细胞凋亡。Kim等[12]的研究表明，姜黄素可诱导Hras转化的MCF10A人类乳腺癌细胞凋亡，同时认为氧化还原反应为姜黄素诱导MCF10A细胞凋亡的机制之一。Radhakrishna等[13]观察了姜黄素诱导H1299肺癌细胞系的凋亡，结果证实在瘤细胞发生凋亡的同时，姜黄素具有时间和浓度的依赖性。本实验通过从甲基绿派洛宁染色结果观察到姜黄素组大大增加了瘤体中凋亡细胞的数量，与文献报道一致。电镜的结果也证实了这一点。电镜下姜黄素组的瘤细胞具有凋亡细胞特性的细胞更多，而且镜下可见典型的凋亡小体。姜黄素对免疫器官影响的文献报道较少。本实验结果显示姜黄素组小鼠的胸腺指数与空白对照组无显著性差异，说明姜黄素对免疫器官的功能无明显影响。另外，姜黄素对肿瘤细胞系的辐射敏感性有明显的增强作用，张晓智等[14]研究结果显示姜黄素可显著提高食管癌细胞系Ecal 09的放射敏感性,我们将继续研究姜黄素对S180小鼠的放射增敏效应。
综上所述，姜黄素具有抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，保护免疫功能，有可能成为一种有效的预防和治疗肿瘤的中药。
文献：
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