小鼠混合骨髓移植中脾细胞诱导持久稳定嵌合体的作用

             作者：吴迪，张梅，贺鹏程，徐汇，李静，蔡瑞波

【关键词】  骨髓移植；嵌合体；移植物抗宿主病；脾细胞

　　摘要：目的  通过小鼠混合骨髓移植模型，将同基因和半相合异基因小鼠骨髓细胞和不同比例脾细胞混合移植给受鼠，探讨诱导持久稳定嵌合体、减轻严重移植物抗宿主病(GVHD)的方法。方法  受鼠60Co全身照射，混合输入同基因和半相合异基因供鼠骨髓，同时将两者脾细胞按不同比例混合回输。测定嵌合体形成，观察GVHD表现及病改变，监测移植鼠生存率。结果  小鼠移植后全部存活超过90d，半相合异基因小鼠脾细胞输注剂量和比例对嵌合体形成的水平和嵌合状态的稳定性有显著影响。结论  调整半相合异基因与同基因小鼠脾细胞输注剂量和比例对诱导异体持久植活、避免严重的GVHD的出现具有实际意义。

　　关键词：骨髓移植；嵌合体；移植物抗宿主病；脾细胞

　　Efficacy of splenocytes in inducing stable longterm chimerism in murine　mixed haploidentical MHC matched bone marrow transplant model

　　ABSTRACT: Objective  To explore the method of inducing stable chimerism without severe graft versus host disease (GVHD) in murine mixed transplant model. Methods  Recipient mice given 60Co wholebody irradiation were infused with syngeneic and H2 haploidentical matched bone marrow plus different proportion of splenocytes. The level of the chimerism of the recipient mice was detected by flow cytometry. The manifestations and histopathological examination of GVHD were observed. The mortality of the recipient mice from GVHD was observed. Results  All the mice survived over 90 days. The dose of H2 haploidentical matched splenocytes showed a great influence on the level and stability of chimerism. Conclusion  It is critical to adjust the dose of H2 haploidentical matched and syngeneic splenocytes in inducing stable chimerism and avoiding GVHD.

　　KEY WORDS: bone marrow transplant; GVHD; chimera; splenocyte

　　移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)和移植排斥一直是骨髓移植存在的障碍。临床上常在移植前去除移植物中的淋巴细胞，或在移植后给予大量的免疫抑制剂来控制移植物抗宿主病。去除移植物中的T淋巴细胞在一定程度上减轻了GVHD，但肿瘤的复发率增大，移植物成活的几率降低，延迟了免疫重建［1］。如果长期应用免疫抑制剂可引起肿瘤、感染和各种代谢性疾病。如何在一个合适的同／异基因成熟淋巴细胞比例下，促进异体移植物的持久植活而又不发生严重的GVHD？本文通过建立小鼠混合半相合骨髓移植模型，调整同基因和半相合异基因小鼠脾细胞输注比例，观察其对形成持久稳定的嵌合体以及GVHD的程度的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  ①BALB/C小鼠(H2d): 部分作为实验组受鼠，部分为同基因供鼠，均为雌性，体重18-20g；②BALB/C×C57BL/6杂交鼠CB6F1(H2d/b):为半相合异基因供鼠，均为雄性，体重18-20g。供、受鼠为清洁级动物，购于第四军医大学实验动物中心，饲养在该中心层流房千级仓中。

　　1.2  主要试剂和器械  PEH2Kb及FITCH2Kd单克隆抗体购于美国Biolegend公司，小牛血清购于兰州民海生物工程有限公司，RPMI 1640培养液购买于美国Gibco公司，检测嵌合体所用流式细胞仪(EpicsEliteEps型)为美国Coulter公司产品 。

　　1.3  受鼠BALB/C的预处理  照射前5d到移植后2周BALB/C小鼠饮用加有庆大霉素(32×104u/L) 和红霉素(250mg/L)的灭菌蒸馏水。在移植前6h， 60Co全身照射，总剂量8.5Gy，剂量率为228cGy/min。

　　1.4  供鼠骨髓与脾细胞的准备  断颈处死小鼠后，投入盛有250mL左右的750mL/L乙醇中，浸泡10min。无菌条件下采集BALB/C小鼠和CB6F1小鼠股骨及脾脏。将股骨两端软骨剪去，露出红色的骨髓腔。用5mL无菌注射器吸取含100mL/L小牛血清的RPMI 1640液5mL，换装一个4号针头，轻轻插入骨髓腔，反复冲出骨髓腔内的骨髓。PBS洗涤2次,计数并用含100mL/L小牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为1×108/mL备用。脾脏经200目筛网研磨成单个细胞悬液, 8.5g/L NH4Cl裂解红细胞，PBS洗涤2次，用含100mL/L小牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为0.5×108/mL备用。

　　1.5  骨髓移植及分组  将BALB/C受鼠随机分为4组，经尾静脉输注移植物。 具体分组如下：A组，15只，每只输注BALB/C小鼠和CB6F1小鼠混合骨髓细胞(1∶1)2×107个及BALB/C小鼠脾细胞0.5×107个；B组，15只，每只输注BALB/C小鼠和CB6F1小鼠混合骨髓细胞(1∶1)2×107及混合脾细胞(1∶1)1×107个；C组，15只，每只输注BALB/C小鼠和CB6F1小鼠混合骨髓细胞(1∶1)2×107及混合脾细胞(1∶2)1.5×107个。对照组，5只，单纯照射，不进行移植。受鼠继续饲养在层流房千级仓中。

　　1.6  观察指标  ①嵌合体的检测。分别在移植后＋70d、+150d A、B、C组小鼠随机各取3只眼球取血后，应用流式细胞术分析方法，用PEH2Kb及FITCH2Kd单克隆抗体，来确定受鼠外周血淋巴细胞中半相合异基因供者来源的细胞比例。方法：取肝素抗凝全血50μL置于专用管中，每样品按1μg/106细胞加入PEH2Kb和FITCH2Kd单抗，对照管加入两种无关抗体，充分混匀后置于4℃冰箱避光染色15-30min，加入红细胞裂解液除去红细胞，1000r/min离心5min，移去上清液，PBS洗涤2次，加入PBS 500μL重悬成单细胞悬液,上机检测。②大体观察和病理检查。观察受鼠体重变化、有无弓背体位、脱毛和每日大小便情况等。有GVHD表现的小鼠临死前均取肝、小肠和皮肤组织，用40g/L甲醛液固定, 常规石蜡包埋、切片，HE 染色， 光镜下观察。存活的小鼠亦在测定嵌合率，眼球取血后处死，取肝、小肠和皮肤组织做病理检查。存活时间超过90d为长期生存，小鼠存活率。

　　1.7  统计学处理  采用 SPSS13.0统计软件包根据实验资料选用方差分析。计量参数以均数±标准差表示，存活率以%表示。

　　2  结果

　　2.1  嵌合体的检测  +70d外周血淋巴细胞中半相合异基因供鼠来源的细胞所占比例，A组为(47.62±0.66)%，B组为(58.57±0.41)%，C组为(60.00±0.90)%；+150d A组为(7.83±3.13)%，B组为(38.31±1.61)%，C组为(54.28±1.85)%。3组间嵌合率比较差异显著 (F=315.681，P<0.01)。移植后150d内，A、B、C组小鼠体内均可测到半相合异基因供鼠源性细胞, 说明半相合异基因供鼠源性细胞植入成功。嵌合体模型随着时间推移，其嵌合率逐渐下降，A组小鼠嵌合率下降幅度最大，C组小鼠形成的嵌合体持久稳定(图1、图2)。

　　图1  移植后 70d嵌合体的测定结果（略）

　　Fig.1 Flow cytometric analysis of the degree of chimerism on the 70th day after BMT

　　A: 47.3%; B: 58.9%; C: 61.0%

　　图2  移植后150d嵌合体的测定结果（略）

　　Fig.2 Flow cytometric analysis of the degree of chimerism on the 150th day after BMT

　　A: 11.0%; B: 39.6%; C: 58.7%

　　2.2  GVHD表现、存活率和病理检查  单纯照射对照组小鼠照射后出现精神萎靡，体重逐渐减轻，2周内全部死亡，说明预处理方案为清髓性。A、B、C组小鼠均长期存活超过90d。A组，小鼠观察不到急性GVHD的临床表现,肝、小肠及皮肤的病理检查未发现异常变化。B组，也无明显GVHD临床表现，肝、小肠和皮肤病理检查为轻度炎症反应。C组，该移植模型可诱导出典型的弓背体位，但无脱毛、腹泻及体重减轻等其他表现。肝脏病理切片可见肝细胞斑点状浊肿, 有淋巴细胞浸润， 汇管区、中央静脉和肝血窦扩张、淤血，为急性GVHD Ⅱ级改变(图3)。

　　图3  移植组小鼠的肝脏病理改变（略）

　　Fig.3 Histological changes of transplant mice (HE×400)

　　A: histological changes in the liver of group B mice; B: histological changes in the liver of group C mice

　　3  讨论

　　同自体骨髓移植相比，混合骨髓移植在诱导嵌合体形成的同时，具有减轻GVHD的严重程度和产生移植物抗白血病(graft versus leukemia, GVL)持久效应的优点，因而复发率低，无病生存时间长[2]。据研究显示，小鼠骨髓中淋巴细胞含量仅为2%，单纯异基因骨髓移植无法诱导出GVHD，需要在移植物中加入脾细胞以提升T细胞含量。小鼠脾细胞中淋巴细胞含量高[3]，其中T淋巴细胞约30%-40%，B淋巴细胞约55%-60%，巨噬细胞接近10%。因此，本实验采用小鼠作为研究对象时，在混合半相合骨髓移植模型中，输注同基因和半相合异基因供鼠骨髓的同时，通过输注小鼠脾细胞作为诱导GVHD的实验手段。骨髓移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入水平即嵌合状态的建立和有关。嵌合体一般分为三种类型：完全供者嵌合、微嵌合体和混合嵌合体。其中移植后可以同时检测到供者和受者两种细胞成分，供者细胞占2.5%-97%，称为混合嵌合体，混合嵌合体的成功诱导有赖于输注的干细胞数量等因素[45]。有研究者在H2完全不相合小鼠非清髓骨髓移植中发现单纯增加供鼠骨髓量，并不能够提高供者骨髓植入率。将含有约35%T淋巴细胞的供鼠脾细胞和骨髓一同输入受鼠，嵌合率水平明显提高 [6]。本实验A、B、C组小鼠移植后150d内，外周血淋巴细胞中均可测到半相合异基因供鼠源性细胞, 受鼠体内已形成混合嵌合体。A组, 未混入半相合异基因供鼠脾细胞，150d与70d嵌合率比较下降幅度最大，临床和病理观察不到急性GVHD表现。B组，同基因供鼠和半相合异基因供鼠脾细胞比例1∶1，150d与70d嵌合率比较下降幅度小于A组，临床无显著GVHD表现，肝、小肠和皮肤病理检查为轻度炎症反应。C组，同基因供鼠和半相合异基因供鼠脾细胞比例1∶2，150d与70d嵌合率比较下降幅度最小，所形成的嵌合体持久稳定。该移植模型小鼠出现轻度的GVHD临床表现，肝、小肠和皮肤病理切片均见程度较为一致的急性GVHD Ⅱ级改变。实验结果显示半相合异基因小鼠脾细胞输注剂量和比例越大，嵌合体形成的水平越高，嵌合状态越稳定。调整半相合异基因与同基因小鼠脾细胞输注剂量和比例对诱导异体持久植活而又避免发生严重的GVHD具有实际意义。本实验通过混合输注同基因和半相合异基因供鼠骨髓及两者不同比例脾细胞，初步发现合适的同基因和半相合异基因供鼠脾细胞输注比例和数量可在避免严重的GVHD的基础上诱导持久稳定的嵌合体。但如何能同时加强GVL效应仍需进一步研究。

　　：

　　[1]Ho VT, Stiffer RJ. The history and future of T cell depletion as graftversushost disease prophylaxis for allogenic hematopoietic stem cell transplantation [J]. Blood, 2001, 98(12):31923204.

　　[2]Zhang M, Qi J, Liu SX, et al. Induction of graft versus leukemia effect by mixed bone marrow transplantation [J]. Blood, 2005,106 (11):418.

　　[3]Hashimoto N, Narumi S, Itabashi Y, et al. Efficacy of donor splenocytes mixed with bone marrow cell for induction of tolerance in sublethally irradiated mice [J]. Transplant Immunol, 2002,10:3741.

　　[4]Wekerle T, Kurtz J, Ito H, et al. Allogeneic bone marrow transplantation with costimulatory blockade induces macrochimerism and tolerance without cytoreductive host treatment [J]. Nat Med, 2000,6(4):464469.

　　[5]Durham MM, Bingaman AW, Adams AB, et al. Cutting edge:administration of antiCD40 ligand and donor bone marrow leads to hemopoietic chimerism and donorspecific tolerance without cytoreductive conditioning [J]. J Immunol, 2000,165(1):14.

　　[6]Masak K, Yoshinori I, Shin M, et al. An irradiationfree nonmyeloablative bone marrow transplantation model: importance of the balance between donor Tcell number and the intensity of conditioning [J]. Transplantation, 2005,80(9):11451152.