丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

                 作者：付慧，楚雍烈，张丽莉，曹美茹，成凡，茹小荣，王勇健

【摘要】  目的 克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因。方法 运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18?Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET?28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS?PAGE电泳及Western?blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果 成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论 成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。

【关键词】  丙型肝炎病毒；ns5a基因；基因表达

　　Cloning and expression of ns5a gene of hepatitis Cvirus 1b strain DY in Escherichia coli

　　ABSTRACT: Objective  To clone and express the ns5a gene of hepatitis C virus (HCV) 1b strain DY. Methods  By using the prokaryotic cell gene engineering, HCV ns5a gene was amplified with nested PCR from the plasmid HCV17 of HCV 1b strain DY full?length gene and inserted into the cloning pMD18?T vector. The cloned HCV ns5a gene was separated and subcloned into expression vector pET?28a and induced by IPTG in E.coli. BL21.The expressed product was identified by SDS?PAGE and Western?blot methods. Results  Recombinant expression plasmid pet?28a?ns5a was constructed and expressed successfully. Conclusion  HCV ns5a gene was cloned and expressed. This might be helpful for further studies on the nature and biological properties of the ns5a gene.

　　KEY WORDS: hepatitis C virus (HCV); ns5a gene; gene expression

　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus HCV)是人类血源性传染病的主要病原之一。全球范围内HCV感染人数约为1.7亿[1]，其感染率约为全球人口的3%；我国有将近4000万人感染。HCV感染与肝脏病变密切相关,且易呈慢性化及恶性化。目前对HCV感染的效果有限，而且尚无预防HCV感染的疫苗，故HCV感染已成为全球性严重的社会公共卫生问题。
   
　　HCVns5a基因位于HCV基因组中6258-7601nt，编码约448个氨基酸，NS5A蛋白为高度磷酸化蛋白[2]，是一个很有争议的“多功能”蛋白，对其结构及功能的研究对探讨HCV的致病机理、感染的检测、治疗及疫苗开发等均有非常重要的意义，尤其是NS5A蛋白之中是否存在干扰素敏感性决定区(interferon sensitivity determining region, ISDR)及ISDR与干扰素(IFN)疗效之间关系的研究成为近年来HCV研究的热点内容。
   
　　由于HCV在细胞培养体系中复制效率较低，通过重组表达获得有活性的NS5A蛋白是研究该蛋白功能最有效和实用的方法。因此，本研究对分离自我国丙型肝炎患者血清的HCV1b DY株ns5a基因进行克隆、序列比对和生物信息学分析，构建该基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达NS5A蛋白，鉴定所表达蛋白的抗原性，为研究NS5A蛋白的结构、性质和生物学功能创造条件。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  质粒、菌株及载体  HCV全长cDNA质粒HCV17、E.coliJM109、DH5a、BL21及原核表达载体pET?28a(+)均为本实验室保存，pMD18?T载体购自TaKaRa公司。

　　1.1.2  酶及生化制剂  DNA限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；其他所用试剂主要购自北京天为时代或鼎国公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  质粒提取及纯化  利用碱裂解法小量提取含HCV1b DY株全长的HCV17质粒DNA及pET?28a质粒DNA(阴性对照质粒)，并纯化。

　　1.2.2  引物的设计与合成  NCBI记录的HCV1b各株序列，选取NS5A ISDR两侧高度保守区段设计目的基因的特异性引物(表1)，由上海生物工程公司合成。

　　表1  引物序列（略）

　　Table 1  Location and sequence of primer of amplification

　　1.2.3  目的基因的扩增  利用巢式PCR，依次加入体系中的各成分，以HCV17质粒为模板外引物扩增，再以外引物扩增产物为模板进行内引物扩增。内外引物进行PCR循环，参数如下：94℃预变性10min，94℃变性1min，58℃退火1min 30s，72℃延伸1min，进行30次循环，最后72℃延伸10min。设立阴性对照，以pET?28a质粒DNA为模板进行同样扩增。10g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

　　1.2.4  PCR产物与pMD18?T simple vector连接  具体操作按照pMD18?T simple vector使用说明进行，获得含目的基因的重组质粒。把重组质粒pMD?T?ns5a DNA经转化氯化钙法制备的感受态细胞E.coli.JM109，从Amp+ IPTG/X?GaL LB平板筛选白色菌斑，Amp+LB液体培养基培养过夜，提取质粒，进行PCR、酶切鉴定。

　　1.2.5  克隆HCV ns5a基因的序列比对分析  将重组pMD18?T?ns5a质粒送北京华大基因公司测序，将测序结果与HCV标准株HCVJ序列[3]进行比对分析。

　　1.2.6  原核表达载体的构建  将阳性的重组质粒pMD18?T?ns5a用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，目的基因片段凝胶回收kit进行纯化、回收及定量，与经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的表达载体pET?28a(+)用T4DNA连接酶连接，转化氯化钙法制备的感受态BL21菌，挑取重组菌落扩大培养，提取质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切和PCR再扩增分析，并送华大基因公司测序鉴定。

　　1.2.7  融合蛋白的诱导表达及活性检测  挑取单个菌落在含卡那霉素的LB液中过夜复苏，然后按1∶100接种同样的培养基，37℃通气培养至A600值为0.6左右时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导，分别在诱导0h(未诱导)、1、3、5、7h各取1mL重组菌培养物，同时设空载体诱导作为阴性对照，进行上样处理，SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色。对表达蛋白进行Western blot分析，抗HCV阳性血清为一抗，HRP标记的羊抗人IgG为二抗，按常规方法进行验证其抗原性。

　　2  结果

　　2.1  PCR扩增  为了增加扩增目的片段的特异性和灵敏度，选择了巢式PCR法，设计了内外两对特异性引物，并对PCR反应条件进行了的优化，成功地从含HCV1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增得到目的基因ns5a(含ISDR编码基因)，长度为480bp，与预期大小相符，未见非特异扩增(图1)。

　　图1  琼脂糖凝胶电泳鉴定HCV ns5a 的PCR产物（略）

　　Fig.1 Identification of HCV ns5a products by agarose gel electrophoresis

　　M: 200bp ladder marker; 1-3: HCV17 PCR product, about 500bp; 4: negative control

　　2.2  目的基因插入克隆载体pMD18?T的鉴定  利用分子克隆技术，对目的基因进行亚克隆，构建克隆载体pMD18?T?ns5a，进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆菌落，培养并抽提质粒，进行电泳粗筛、PCR、酶切鉴定。结果显示PCR扩增得到约500bp的产物，与目的基因大小相符；酶切大片段约2.7kb，与pMD18?T大小相符；小片段约500bp，与目的基因大小相符(图2)。证明ns5a基因正确插入pMD18?T载体之中，克隆载体pMD18?T?ns5a构建成功。

　　图2  重组 pMD18?T?ns5a的鉴定（略）

　　Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18?T?ns5a

　　M: 500bp ladder marker; 1: EcoRⅠ digested Lane (3.2kb fragment); 2: EcoRⅠ/SalⅠ digested Lane (2.7kb and 500bp fragments); 3: pMD18?T?ns5a PCR products (500bp fragment); 4: HCV17 PCR products (500bp fragment)

　　2.3  序列比对  对目的基因进行测序，测序结果与引物设计序列一致，证明所扩增片断为HCV 1b ns5a基因。将测序结果与报道的HCVJ标准株相应序列进行核苷酸及氨基酸序列同源性比对，结果：扩增片段长480bp，其中49个核苷酸突变，序列同源性为90%；13个氨基酸变异，序列同源性为92%；ISDR氨基酸有4个变异。即确定HCV1b DY株在ns5a区存在突变位点(图3)。

　　2.4  目的基因插入原核表达载体pET?28a(+)的鉴定  利用电泳粗筛、PCR 、酶切及测序鉴定，结果与预期相符，证明原核表达载体pET?28a(+)?ns5a构建成功(图4)。

　　2.5  融合蛋白的诱导表达及活性检测  对含重组质粒pET?28a(+)?ns5a的工程菌BL21(DE3)进行培养，并用诱导剂IPTG进行诱导表达，SDS?PAGE电泳结果显示：与未诱导的重组菌和诱导空载体转化菌进行比较，在分子质量为24ku(目的蛋白为18-20ku，标签蛋白4ku)处有显著的新生蛋白表达(图5)。
　　
　　2.6  表达产物鉴定  为了验证所得到的融合蛋白NS5A的抗原特异性，进行了Western?blot试验来进行鉴定。在相对分子质量24ku处目的条带染色清晰，说明表达的重组融合蛋白HCV NS5A蛋白有很好的抗原特异性，具有与HCV阳性血清的结合活性(图6)。

　　图3  HCV1bDY株ns5a基因测序结果与HCVJ标准株核苷酸及氨基酸序列同源性比较（略）

　　Fig.3 Comparisons of the sequence of nucleotide and deduced amino acid of HCVJ with the gene fragment　of HCV?ns5a

　　图4  重组pET?28a?ns5a鉴定结果（略）

　　Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET?28a?ns5a

　　1: λDNA HindⅢ marker; 2: EcoRⅠ/SalⅠ digested lane (5.4kb and 500bp fragments); 3: EcoRⅠ digested lane (5.9kb fragment); 4: pET?28a?ns5a PCR products (500bp fragment); 5: DL2000 marker

　　图5  重组质粒pET28a?ns5a IPTG诱导表达结果的SDS?PAGE电泳图（略）

　　Fig.5 SDS?PAGE gel electrophoresis of pET28a?ns5a was induced by IPTG

　　1: protein marker; 2: pET28a?ns5a was not induced; 3-6: pET28a?ns5a was induced at different hour 1, 3, 5, 7; 7: pET?28a expressed

　　图6  Western?blot结果（略）

　　Fig.6 Results of Western?blot

　　1: Western?blot result of pET28a?ns5a; 2: negative control; 3: SDS?PAGE of protein marker

　　3  讨论
   
　　近年来，对HCV感染导致的丙型肝炎的研究，核心问题集中在HCV基因结构分析、提高药物疗效以及制备HCV疫苗研究等方面。目前，针对HCV感染，主要通过α?干扰素(INF?α)与病毒唑(ribavirin)的组合疗法[4]进行，但治愈率低，各基因亚型中尤以1b亚型的干扰素疗效较差。近年来，日本学者Enomoto等[5]对1b亚型的耐干扰素机理做了基因方面的研究,认为NS5A内的40个氨基酸序列(2209?2248nt)与干扰素疗效有关,是决定干扰素治疗敏感与否的重要因素，被称为干扰素敏感性决定区(ISDR)。这被认为是不同基因型的HCV对干扰素治疗反应性差异的分子生物学基础。但是,欧美及我国的学者[6?7]未发现类似的对应关系，他们推测NS5A ISDR区外的序列可能与干扰素疗效相关，因而对ISDR区的研究存在很大的争议。要研究ISDR序列与IFN疗效的关系，建立稳定的无性繁殖系，进行同源性分析是必备的。因此，我们克隆了(HCV)1b型地方株DY株含ISDR的ns5a部分基因，测序并与HCV J序列进行比对，确定其同源性，发现存在突变位点。此类研究在国内鲜有报道，这对研究当地临床丙型肝炎的诊断、治疗等都有潜在的应用价值。当前,不管是开发丙型肝炎病毒高效抗体检测试剂盒还是研制HCV疫苗，选择具有很好抗原特异性及免疫原性的抗原是关键因素[8]。因此，本研究进一步构建了原核表达载体pET?28a?ns5a，并在大肠杆菌中出表达了带His标签的融合蛋白NS5A蛋白，并对其进行免疫原性分析，为研制以NS5A蛋白为抗原的丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、开发HCV疫苗及抗HCV药物提供了一个新型、潜在的有效靶标，亦为体外筛选新型抗HCV药物奠定了基础。

基金项目：国家基金资助项目(No.30470089)；国家高技术研究计划 (863)资助项目(No.2002AA21416)

【参考文献】
  　　[1]Rosen HR, Gretch DR. Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies [J]. Molecular Medical Today, 1999, 5:393?399.

　　[2]王迪,张雪,杨复华,等. The molecular biology of hepatitis C virus proteins [J]. 病毒学杂志, 2004,19(5):526?530.

　　[3]Nobuyki K. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non?A non?B hepatitis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:9524?9528.

　　[4]McHutchison, Patel JG. Future therapy of hepatitis C [J]. Hepatology, 2002, 36(1):245?252.

　　[5]Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C virus lb infection [J]. N Engl J Med, 1996, 334:77?81.

　　[6]段学章,朱传琳,程云,等. 丙型肝炎病毒1b型NS5A基因结构变异与a干扰素治疗效果的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1999, 13(4):368?370.

　　[7]唐振亚，Kock J, Moradpour D,等. 慢性丙型肝炎患者干扰素敏感决定区突变的意义 [J]. 中华肝脏病杂志, 1999, 7(1):57.

　　[8]安润,楚雍烈,杨娥,等. 丙型肝炎病毒非结构蛋白3全长基因的克隆和表达 [J]. 西安大学学报(医学版), 2006, 27(5):449?451.