水飞蓟宾固体脂质纳米粒的制备及抗肝纤维化作用
作者：厉英超 董蕾 贾皑 苌新明 薛挥
【摘要】 目的 制备载中药水飞蓟宾(SIL)的固体脂质纳米粒(SLN)，并观察其对肝硬化模型大鼠的抗肝纤维化作用。方法 采用高压乳匀法制备SIL?SLN，实验大鼠分为正常对照组、模型对照组、SIL普通剂型组、SIL?SLN灌胃组和SIL?SLN静脉注射组，比较SIL的SLN剂型与普通剂型的抗肝纤维化作用。结果 高压乳匀法制备的SIL?SLN呈圆形，形态规则，粒径为(157±8)nm，Zeta电位为(-35.36±2.68)mV，平均包封率为95.64%，平均SIL含量为1.501g/L。给药8周后，SIL?SLN灌胃组和SIL?SLN静脉注射组的大鼠肝脏Masson胶原染色图像分析灰度值分别为4.73±1.35和2.26±0.42，与SIL普通剂型组(7.26±1.72)比较差异有显著性(P<0.05)，且SIL?SLN静脉注射组作用优于SIL?SLN灌胃组(P<0.05)。结论 SIL?SLN可显著提高SIL的抗肝纤维化作用，静脉注射作用更强，是一种新型中药靶向制剂。
【关键词】 水飞蓟宾；固体脂质纳米粒；肝纤维化；高压乳匀法；中药化
Preparation and anti?fibrotic effects of solid lipid nanoparticles loaded with silibinin
ABSTRACT: Objective To prepare solid lipid nanoparticles (SLN) loaded with silibinin (SIL) extracted from traditional Chinese medicine and study the anti?fibrotic effects in model rats of liver cirrhosis. Methods SIL?SLN was prepared by high pressure homogenization. Experimental rats were randomly divided into normal control group, model control group, SIL?suspension oral group, SIL?SLN oral group, and SIL?SLN intravenous (iv) group. The anti?fibrotic effects of normal drug delivery and SLN of SIL were compared. Results The SIL?SLN prepared by high pressure homogenization was spherical and regular in shape. The particle diameter was (157±8) nm and the zeta potentials was (-35.36±2.68)mV. The mean entrapment efficiency was 95.64% and the mean drug content was 1.501g/L. After administration of SIL for 8 weeks, the gray values of Masson?s trichrome staining in rats liver tissues of SIL?SLN oral group and SIL?SLN iv group were 4.73±1.35 and 2.26±0.42, respectively, and the differences were significant compared with SIL?suspension oral group (7.26±1.72, P<0.05). The anti?fibrotic effect of SIL?SLN iv group was better than SIL?SLN oral group (P<0.05). Conclusion The anti?fibrotic effect of SIL?SLN was much higher than SIL?suspension, especially by intravenous injection. SLN is a new targeting drug delivery of traditional Chinese medicines.
KEY WORDS: silibinin; solid lipid nanoparticles; liver fibrosis; high?pressure homogenization; modernization of traditional Chinese medicines
固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是在20世纪90年代初起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合纳米粒的新型胶体给药系统[1?2]。SLN以固态的天然或合成的类脂为载体，将药物包载于类脂中制成，平均粒径约50-1000nm。SLN作为药物载体可提高药物的生物利用度[3?4]，主要用于静脉给药，达到靶向与控释作用，也可用于口服给药，以控制药物在胃肠道内的释放，增加药物的吸收。水飞蓟素是由菊科植物水飞蓟Silybum marianu (L.) Gaertn.果实中提取得到的水难溶性黄酮类化合物，水飞蓟宾(silibinin, SIL)为主要成分，分子式为C25H22O10，以其为主药的制剂是临床上常用的保肝、抗肝纤维化药物。由于SIL难溶于水，生物利用度低，目前国内外都在积极研制其新剂型。本实验采用高压乳匀法制备SIL?SLN，对其形态、粒径、Zeta电位、包封率、药物含量等重要性质进行了研究，并观察了其对肝硬化模型大鼠的抗肝纤维化作用。
1 材料与方法
1.1 材料 SIL由盘锦格林恩生物资源开发有限公司提供，纯度95%。豆磷脂购自北京奥博星生物技术责任有限公司。硬脂酸购自天津市天大化学试剂厂。胆固醇购自上海政翔化学试剂研究所。雄性Sprague?Dawley (SD)大鼠由西安大学医学院实验动物中心提供。
1.2 SIL?SLN的制备 经过单因素考察和正交试验设计优化，确定较优制备工艺[5?6]。以BP?121S型天平(德国Sartorius公司)精确称取1.5g硬脂酸、1.0g豆磷脂和75mg SIL，在70℃水浴中溶解于10mL无水乙醇中，形成有机相溶液。量取45mL甘油分散于75mL蒸馏水中形成水相。将水相置于恒温磁力搅拌器上，温度为80℃，将有机相注入水相中，搅拌2h，使成乳白色混悬液，形成初乳。在APV2000高压乳匀机(丹麦APV公司)上50MPa乳匀5次，即得SIL?SLN，4℃密封保存。
1.3 电镜观察SIL?SLN的形态 取一滴SIL?SLN滴加至铜网上，用20g/L磷钨酸负染30s，在H?600透射电子显微镜(日本Hitachi公司)下观察并拍摄照片。
1.4 粒径及Zeta电位的测定 取SIL?SLN适量，蒸馏水稀释20倍后，用Mastersizer 2000 粒度分析仪(英国马尔文公司生产)和Zetasizer Nano 电位分析仪(英国马尔文公司生产)分别测定所制备的SLN的粒径和Zeta电位。按照上述方法制备9份样品，平均粒径和Zeta电位(n=9)。
1.5 包封率与药物含量的测定 色谱条件：色谱柱为Planetsil C18(4.6mm×15cm)柱；流动相为甲醇与0.1mol/L磷酸盐缓冲液(用磷酸调至pH3.0，35∶65)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长288nm。将SIL?甲醇对照品储备液用流动相稀释成0.055、0.222、0.887、3.547、14.19、28.38、56.75、113.50mg/L，以LC?2010高效液相色谱仪(日本岛津公司生产)进行测定。以SIL质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归分析，判断线性关系。精确量取SIL?SLN水分散体0.5mL，用流动相定容至5.0mL，测定其中SIL含量(W1)。移取SIL?SLN 0.5mL上样于填充好的Sephadex凝胶柱，以蒸馏水为洗脱剂，接取其中带有白色乳光的部分，定容至5.0mL，应用高效液相色谱仪测定其中SIL含量(W2)。包封率按以下公式计算：包封率(%)=W2/W1×100%。高压乳匀法制备9份样品，分别计算平均包封率和平均SIL含量(n=9)。
1.6 实验大鼠的分组和造模 雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠46只，体重220-270g，平均242g，将其随机分为以下5组。①正常对照组：随机取6只大鼠，正常饮水饮食，皮下注射花生油，3mL/kg体重，每周2次，共8周。其余40只大鼠，随机分为4组，每组10只大鼠，即②模型对照组、③SIL灌胃组、④SIL?SLN灌胃组、⑤静注SIL?SLN组，均按以下方法制造肝纤维化模型[7]：5%(体积分数)乙醇为唯一饮料，高胆固醇(0.5%)高脂饮食，皮下注射400mL/L四氯化碳花生油溶液，3mL/kg体重，每周2次，首剂加倍，共8周。
1.7 抗肝纤维化的 在造模的同时各治疗组(③-⑤组)大鼠分别按照不同的给药途径给予SIL的不同剂型药物进行抗肝纤维化治疗。③SIL灌胃组：普通SIL?生理盐水混悬液灌胃，每次20mg/kg体重，每周2次；④SIL?SLN灌胃组：SIL?SLN水分散体灌胃，每次20mg/kg体重，每周2次；⑤静注SIL?SLN组：尾静脉注射SIL?SLN水分散体，每次20mg/kg体重，每周2次。
1.8 标本采集与处理 每组大鼠均于8周末处死，开腹观察肝脏外观形态，取大鼠肝脏右叶小块组织以25mL/L戊二醛固定，用于电镜检查；另取右叶小块组织以100mL/L甲醛固定，留作HE、Masson三色染色。
1.9 统计学处理 数据用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，P<0.05即差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SIL?SLN的形态 按照上述方法制得的SIL?SLN水分散体，其外观性状为带乳白色光泽液体。在透射电镜下观察(负染)，SIL?SLN呈圆形，形态规则(图1)。
图1 高压乳匀法制备的SIL?SLN（略）
Fig.1 SIL?SLN prepared by high pressure homogenization(×40000)
2.2 粒径与Zeta电位 高压乳匀法制备的SIL?SLN平均粒径为(157±8)nm。平均Zeta电位为(-35.36±2.68)mV，Zeta电位的分布如图2所示。
图2 SIL?SLN的Zeta电位分布图（略）
Fig.2 Zeta potential distribution of SIL?SLN
2.3 包封率及药物含量 SIL质量浓度在0.055-113.50mg/L时，峰面积(A)与药物浓度(C)有良好的线性关系，回归方程为A=3307.1C+9910.2，R2=0.9998。测定的柱回收率(高)为98.99%，柱回收率(低)为98.49%，柱回收率的平均值为98.96%。依照上述色谱条件与方法测量，按公式计算包封率，SIL?SLN的包封率为(95.64±1.33)%。SIL?SLN水分散体中SIL含量平均值为1.501g/L。
2.4 动物与肝脏的大体情况 制备肝纤维化模型过程中，正常对照组的大鼠毛色光润，体重逐渐增加，活动良好。正常对照组6只大鼠中无1例死亡。而造模的大鼠毛色杂乱无光泽，精神差，活动少，进食减少，体重减轻。于造模第3周起开始出现死亡，至8周末实验结束时②-⑤组实际大鼠数量为6只、8只、7只、7只。造模大鼠总死亡率为31.4%。大鼠死亡原因有：皮肤溃疡感染、肺部感染、肺脓肿、血尿等。造模过程中大鼠体重逐渐下降，以模型对照组最为显著。模型对照组大鼠肝叶缩小，边缘不规则，颜色变(浅)为砖红色，质地变硬，表面呈细小颗粒状结节，少数大鼠有腹水形成。正常对照组大鼠肝脏表面光滑，颜色暗红，质地柔软。各组大鼠肝脏大体观察、硬化程度较模型对照组轻，需进一步实验准确判断。
2.5 SIL?SLN的肝内分布 SIL?SLN灌胃和静注给药后，均可见SIL?SLN在肝脏中的分布。SLN被肝脏内Kupffer细胞吞噬，主要分布于溶酶体内，透射电镜照片见图3。溶酶体内较小的黑色致密圆形颗粒即为SIL?SLN，较大的白色透亮圆形颗粒为溶酶体内的脂滴。
图3 Kupffer细胞溶酶体内可见大量的SIL?SLN（略）
Fig.3 SIL?SLN in the lysosome of Kupffer cell (×20000)
2.6 抗肝纤维化作用 ①HE染色：正常对照组可见肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，未见纤维间隔增生及炎细胞聚集。模型对照组可见纤维组织明显增生，纤维间隔包绕肝细胞形成假小叶，除汇管区、纤维间隔以外肝细胞间梭形细胞数目增多，汇管区及中央静脉周围可见大量炎性细胞浸润，肝细胞有脂肪变性。各治疗组肝纤维化较轻，多数纤维组织增生不明显，纤维间隔形成不完全，未见假小叶，梭形细胞数目少，炎性细胞仅少量存在，肝细胞有脂肪变性。②Masson三色染色：正常对照组可见肝小叶结构完整，胶原纤维增生不明显。模型对照组可见胶原纤维明显增生，沿变性坏死的肝细胞间伸展，形成纤维间隔，纤维间隔包绕肝细胞形成假小叶。各治疗组可见肝细胞脂肪变性，变性坏死较轻，胶原纤维增生程度较轻，由汇管区深入小叶内，多数尚未形成假小叶。各组Masson三色染色图像分析灰度值如表1所示。SIL?SLN灌胃组和SIL?SLN静脉注射组的大鼠肝脏Masson胶原染色图像分析灰度值分别为(4.73±1.35)和(2.26±0.42)，与SIL普通剂型组(7.26±1.72)比较差异有显著性(P<0.05)，且SIL?SLN静脉注射组作用优于SIL?SLN灌胃组(P<0.05，表1)。
表1 各组实验大鼠肝脏Masson三色染色图像分析的灰度值（略）
Table 1 Gray values of Masson?s trichrome staining in rats liver tissues of all groups
*P<0.05 vs. normal control; ⊿P<0.05 vs. model control; #P<0.05 vs. SIL? suspension oral; ▲P<0.05 vs. SIL?SLN oral
3 讨论
SIL新剂型的研究，对于提高SIL的生物利用度，扩大应用范围，增强其药理作用具有重要意义。以生理相容的高熔点脂质为骨架材料制备的SLN，在室温下通常呈固态，因此既具备聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏慢、控制释放的优势，又兼具了脂质体、乳剂的毒性低、生理相容、可生物降解、能大规模生产的优点[8?9]；同时避免了二者的明显缺点——聚合物纳米粒制备时使用的有机溶剂在技术上不可能完全去除，脂质体、脂肪乳中药物的突释现象。所以，SLN是一种极有前景的新型给药系统的载体。除SIL外，其他很多脂溶性的中药有效成分均可制备成SLN剂型，以提高其生物利用度，达到控释和靶向的目的，减少毒副作用。将纳米技术引入中药领域，将可能为中药发展提供新的动力，带来全新的中药加工方法和全新的中药剂型，成为促进中药化的有益尝试。
肝Kupffer细胞是体内固定型巨噬细胞中最大的细胞群体，约占细胞总数的80%。纳米胶体微粒药物释放系统如SLN经静脉注射后，主要被体内网状内皮组织系统(RES)丰富的器官如肝脏中的Kupffer细胞所吞噬，被动趋向于肝脏，有利于肝脏疾病的治疗。SLN口服(或灌胃)后，可能在小肠中以整体形式转运到体循环中[10]。所以，无论SIL?SLN灌胃或静脉给药后，均可见SIL?SLN在肝脏Kupffer细胞内的分布。而后，SLN在肝脏中将药物缓慢的释放出来作用于局部，部分药物通过肝脏重新回到血液中，或通过肝肠循环进入血液中，也延长了药物在血浆中的作用时间。
SIL是临床上常用的保肝、抗肝纤维化中药的有效成分。本实验通过复合病因制造的大鼠肝纤维化模型，研究发现SIL?SLN剂型在对抗实验大鼠肝纤维化的作用方面明显优于普通剂型，而且SIL?SLN的静脉注射组疗效优于口服(或灌胃)组。其机制可能主要与SLN提高SIL的生物利用度、SLN的肝靶向性、SIL与SLN中磷脂的双重保肝药效(协同作用)、药物的控释作用等有关。
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