SB203580对NO诱导兔关节软骨细胞NF-κB表达的影响
作者：王红林 王治伦 陈静宏 吴劲 考希宾 高艳
【摘要】 目的 探讨p38 MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞NF?κB蛋白表达的影响。方法 体外培养兔关节软骨细胞，经甲苯胺兰染色鉴定后，一氧化氮(NO)供体NOC?18和p38 MAPK抑制剂SB203580作用于细胞24h，用MTT比色法检测细胞增殖活性，Western blot测定NF?κB p65亚单位蛋白表达水平。结果 与对照组比较，NOC?18能抑制软骨细胞MTT增殖活性(P<0.05)；NOC?18诱导的NF?κB p65活性的升高被SB203580抑制(P<0.05)，而仅有SB203580作用于细胞时，与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。结论 p38 MAPK促进了NO诱导的兔关节软骨细胞NF?κB的表达，NO致软骨细胞凋亡的信号通路中涉及了NF?κB的活性表达。
【关键词】 NO；SB203580；软骨细胞；NF-κB
Effect of SB203580 on NF?κB expression induced by nitric oxide in rabbit articular chondrocytes
ABSTRACT: Objective To explore the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on chondrocyte protein expression of NF?κB. Methods Rabbit articular chondrocytes were cultured in vitro, and identified using toluidine blue staining. Following treatment with nitric oxide (NO) donor NOC?18 and p38 MAPK inhibitor SB203580 for 24h, we performed MTT assay to evaluate the proliferation of cells, and Western blotting to determine the protein expression of NF?κB p65. Results NOC?18 significantly reduced chondrocyte proliferation, compared with untreated controls (P<0.05); SB203580 was able to suppress the accelerated activity of NF?κB p65 induced by NOC?18 (P<0.05). However, there was no significant difference when treated only with SB203580, compared with the control (P>0.05). Conclusion The p38 MAPK promotes NO?induced rabbit articular chondrocyte NF?κB expression, and the increase of NF?κB expression is involved in NO?induced chondrocyte apoptosis pathway.
KEY WORDS: nitric oxide (NO); SB203580; chondrocyte; NF?κB
软骨细胞在炎症刺激或外源性一氧化氮(nitric oxide, NO)供体如硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)、亚硝基化合物(nitrosocompound, NOC)等作用下可产生大量NO[1]。越来越多的证据表明，NO与骨关节疾病的发病机制密切相关[2?3]，它能抑制软骨细胞增殖,诱导软骨细胞凋亡[4?5]。Kim等研究认为，p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen?activated protein kinase, MAPK)通路在NO诱导软骨细胞凋亡中发挥了重要作用，其机制可能为：NO激活p38，继而活化核因子?κB(nuclear factor kappa B, NF?κB)，再经由复杂通路最终导致软骨细胞发生凋亡[6]。另有研究报道，p38虽参与了IL?1引起的软骨损伤，但p38 MAPK信号通路与IL?1诱导的NF?κB活性无关。因此，p38和NF?κB是两条不同的引起软骨细胞损伤的通路[7]。本实验通过体外培养兔关节软骨细胞，研究p38 MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞活性以及NF?κB蛋白表达的影响，为了解软骨细胞凋亡发生的机制和指导骨关节疾病的提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 3周龄新西兰兔1只，重约0.5kg；Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)；DME/F?12细胞培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)；甲苯胺兰(美国Amresco公司)；NOC?18(德国Merck公司)；SB203580(美国Promega公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(华美生物工程公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；兔抗β?actin抗体(美国Lab Vision公司)；兔抗NF?κB p65抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL检测试剂盒(美国Pierce公司)。
1.2 关节软骨细胞的分离培养 无菌条件下分离兔关节软骨，用解剖刀将之切成约1mm3大小的碎块，分别采用透明质酸酶、胰蛋白酶和II型胶原酶分阶段消化,获得高成活率、成分均一的关节软骨细胞，接种于DME/F?12培养基中，内含25%-30%的胎牛血清、105u/L青霉素、100mg/L链霉素，置入37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。倒置相差显微镜(Olympus)下观察细胞生长状况，隔天换液，原代细胞10d左右铺满单层，胰酶?EDTA消化传代。根据实验设计，分别接种于培养瓶和24、96孔板，传代细胞7d左右融合成单层。所有实验均采用第一代软骨细胞以避免去分化的问题。
1.3 甲苯胺兰鉴定 待24孔板内软骨细胞贴壁爬片后，0.01mol/L PBS漂洗细胞两次，70%(体积分数)乙醇固定20min，再用PBS漂洗两次，取出细胞爬片固定在载玻片上，室温干燥。2g/L甲苯胺兰染液染色20min，迅速用无水乙醇漂洗一次，显微镜下观察并照相。
1.4 NOC?18和SB203580对软骨细胞的处理 第一代软骨细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察90%的细胞融合，即进行干预。所有细胞先在无血清DME/F?12培养液中置入37℃、5%(体积分数)CO2恒温培养箱培养24h，以减少血清对实验的干扰，然后被分为两组。第一组用终浓度分别为0(control 1)、0.025、0.1、0.4、0.8mmol/L的NO供体NOC?18继续作用24h；第二组按如下设计培养24h：control 2[含20mL/L二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)的培养液，DMSO是SB203580的溶剂]、SB203580 1μmol/L、NOC?18 0.4mmol/L+SB203580 1μmol/L、SB203580 10μmol/L、NOC?18 0.4mmol/L+SB203580 10μmol/L、SB203580 20μmol/L、NOC?18 0.4mmol/L+SB203580 20μmol/L。细胞用p38MAPK抑制剂SB203580预处理30min后再加入NOC?18。
1.5 MTT比色法检测细胞的活性 传代细胞接种于96孔板，用NOC?18刺激24h后，每孔加入5g/L MTT溶液20μL，37℃孵育4h，弃上清，每孔加150 μL DMSO，振荡10min，酶标仪(德国BMG)490nm测A值，每个浓度设6个复孔。
1.6 蛋白印迹法检测NF?κB的表达 第一代软骨细胞经NOC?18和SB203580处理后，用Trizol和异丙醇、盐酸胍等提取总蛋白，蛋白用牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)标准曲线调整为一致浓度后溶解在10g/L十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)中，每份样品取28μL(含20μg总蛋白)进行100g/L SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至PVDF膜上，将膜置于37℃干燥1h，放入封闭液(含5%脱脂奶粉的TBS?Tween)中封闭1h，分别与兔抗NF?κB p65，β?actin抗体4℃孵育过夜，洗涤(5min×2)，抗兔二抗37℃孵育1h，洗涤(5min×3)，ECL底物显色，X片曝光，凝胶成像系统(美国UVP)分析A值，数据用样品与β?actin的比值表示。实验重复3次。
1.7 统计学分析 数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0软件包进行统计学处理，均以双侧α＝0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 对软骨细胞培养的鉴定 倒置相差显微镜观察软骨细胞生长情况：刚分离出的软骨细胞呈圆形，有较强的折光性，贴壁时间平均10h，延伸时间约24h，2-3d后逐渐在瓶壁表面展开，开始有突起，伸出伪足，逐渐转变成梭形、三角形和不规则的星形。此时，细胞开始分裂增长，10d左右形成单层细胞，细胞排列紧密，突起缩短，并表现有接触抑制作用，细胞的分裂增殖趋于缓慢。传代后，细胞贴壁时间平均3h，延伸时间约7h，7d左右融合成单层细胞(图1A、B)。甲苯胺兰染色可见单层生长区域细胞正染成浅蓝色，有2-3个核仁，核仁呈深蓝色。集落样生长区和多层生长区的中心部位细胞外基质异染成紫红色，细胞核正染成深蓝色(图1C、D)。证明是软骨细胞，可进行以下实验研究。
图1 倒置相差显微镜和甲苯胺兰对软骨细胞培养的鉴定（略）
Fig.1 Identification of inverted phase contrast microscope and toluidine blue to chondrocyte cultures (×200)
A: The third day of the primary chondrocytes; B: The seventh day of the first generation chondrocytes; C: monolayer vitellarium; D: multilayer vitellarium
2.2 NOC?18对软骨细胞活性的影响 本实验采用MTT比色法测定不同浓度NOC?18对软骨细胞活性的影响，结果见表1。NOC?18 0.1mmol/L组与对照组差别无统计学意义(P>0.05)，其余各组与对照组差别均有统计学意义(P<0.05)。
表1 不同浓度NOC?18对兔关节软骨细胞增殖活性的影响（略）
Table 1 The effect of various concentrations of NOC?18 on rabbit articular chondrocyte proliferation activity
*P<0.05 vs. control, #P>0.05 vs. control; MTT: Thiazolyl blue; NOC: nitrosocompound
2.3 SB203580减少NOC?18诱导的NF?κB蛋白的表达 随着NOC?18浓度的增加，NF?κB的表达出现上调的趋势，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(图2A)；相反地，各浓度的SB203580处理细胞后，这种上调受到抑制(P<0.05)，而仅有SB203580作用于细胞时，与对照组比较，表达水平的差别无统计学意义(P>0.05)(图2B)。
图2 NOC?18和SB203580对NF?κB蛋白表达的影响（略）
Fig.2 The effect of NOC?18 and SB203580 on the protein expression of NF?κB
*P<0.05 vs. control, #P>0.05 vs. control ; NF?κB: nuclear factor kappa B; NOC: nitrosocompound
3 讨论
本实验发现，NO能抑制软骨细胞MTT增殖活性，以浓度依赖的方式促进NF?κB蛋白表达水平升高，特异性p38 MAPK抑制剂SB203580能显著抑制其升高。提示NF?κB参与了NO诱导软骨细胞凋亡的p38 MAPK通路。
p38阻断剂种类繁多[8]，而常用于研究的有SB203580和SB242235。SB203580较早就被发现，是一种强大的p38阻断剂，在各种啮齿类动物模型中也表现出强大的抗炎性，晶体结构显示这种阻断剂是结合在p38的ATP口袋(这类酶的常见结构)上，从而与其他物质竞争性地结合ATP口袋。NF?κB是1986年从成熟的B淋巴细胞中抽提出，并能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合的核因子[9]，它是一组蛋白质，称为NF?κB/Rel家族,有5位成员，即Rel A(p65)、Rel B、C?Rel、NF?κB1(p50)、NF?κB2(p52)。成员间可形成同源或异源二聚体，不同的NF?κB二聚体具有不同的结合序列，而且具有不同的转录激活特性。能与DNA结合的NF?κB是一个二聚体，其中p65/p50研究得最多，是由一条相对分子质量为50ku的多肽链(p50)和一条相对分子质量为65ku的多肽链(p65)组成的杂合二聚体，习惯上将p65/p50二聚体称为NF?κB[10]。当NF?κB存在于细胞浆时，NF?κB与抑制蛋白I?κB组成复合物，即NF?κB的p65亚基与I?κB蛋白结合，覆盖p65蛋白的核定位信号，以无活性状态存在。当细胞受到外界因素刺激时，I?κB Ser32和Ser36发生磷酸化而被降解，NF?κB暴露出核定位信号，随之进入核内，使其具有生物活性后,再与DNA链上特异位点结合，从而启动基因转录，诱导基因表达[11]。本实验通过蛋白印迹发现，对软骨细胞进行NO刺激后NF?κB p65亚单位的表达呈浓度依赖性地升高；随着加入SB203580浓度的增加，这种升高随之得到抑制。提示NO致软骨细胞凋亡途径中涉及了NF?κB的活化。
综上所述，NF?κB参与了NO诱导的软骨细胞的凋亡，研究NF?κB抑制剂在此凋亡途径中的作用可进一步探明p38与NF?κB活性的关系，为明确NO诱导软骨细胞凋亡的机制提供依据。
【】
[1]杨占田,陈静宏,楚雍烈,等. T?2毒素对软骨细胞合成一氧化氮的影响 [J]. 西安大学学报(医学版) , 2006, 27(02):150?152.
[2]Evans CH, Stefanovic?Racic M, Lancaster J. Nitric oxide and its role in orthopaedic disease [J]. Clin Orthop Relat Res, 1995, (312):275?294.
[3]Murrell GA, Dolan MM, Jang D, et al. Nitric oxide: an important articular free radical [J]. J Bone Joint Surg Am, 1996, 78(2):265?274.
[4]Blanco FJ, Lotz M. IL?1?induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2 [J]. Exp Cell Res, 1995, 218(1):319?325.
[5]陈静宏，楚雍烈，杨占田，等. T?2毒素对胎儿软骨细胞凋亡、Bcl?2和Bax表达的影响及硒的保护作用 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2005, 26(02):130?134.
[6]Kim SJ, Chun JS. Protein kinase C α and ζ regulate nitric oxide?induced NF?κB activation that mediates cyclooxygenase?2 expression and apoptosis but not dedifferentiation in articular chondrocytes [J]. BBRC, 2003, 303(1):206?211.
[7]Mendes AF, Caramona MM, Carvalho AP, et al. Role of mitogen?activated protein kinases and tyrosine kinases on IL?1?induced NF?κB activation and iNOS expression in bovine articular chondrocytes [J]. Nitric Oxide, 2002, 6(1):35?44.
[8]Thurmond RL, Wadsworth SA, Schafer PH, et al. Kinetics of small molecule inhibitor binding to p38 kinase [J]. Eur J Biochem, 2001, 268(22):5747?5754.
[9]Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences [J]. Cell, 1986, 46(5):705?716.
[10]Chen F, Castranova V, Shi X, et al. New insights into the role of nuclear factor?kappa B, a ubiquitous transcription factor in the initiation of diseases [J]. Clin Chem, 1999, 45(1):7?17.
[11]Chen ZJ, Parent L, Maniatis T. Site?specific phosphorylation of I?κBα by a novel ubiquitination?dependent protein kinase activity [J]. Cell, 1996, 84(6):853?862.
