儿童肺炎支原体四种血清学检测方法的比较
【摘要】 目的：通过对儿童肺炎支原体感染不同血清学方法检测的结果比较，评价检测方法对肺炎支原体感染的诊断价值。方法：选用我院儿科住院的肺炎患者395例，分别采用酶联免疫法(ELISA)、金标渗滤法(DIM)检测血清MPAb?IgM，荧光定量PCR（FQ－PCR）检测MP?DNA和冷凝集试验(CAT)。结果：395例小儿肺炎患者受检样品中,87例2岁以下患儿、124例3岁~6岁患儿、184例7岁~14岁患儿的阳性结果及总阳性率分别为冷凝集试验：17例(19.5%)、36例(29.0%)、62例(33.7%)、29.1%；金标渗滤法：31例(35.6%)、53例(42.7%)、85例(46.2%)、42.8%；酶联免疫法：33例(37.9%)、54例(43.5%)、86例(46.7%)、43.8%；荧光PCR法：35例(40.2%)、57例(47.0%)、88例(47.8%)、45.6%。结论：MPAb?IgM是机体受肺炎支原体感染时最早出现的特异性抗体，血清MPAb?IgM检测具有操作简便、检出率与PCR法相当、能早期诊断的优点，特别是金标渗滤法，所需时间最短，又不需要特殊仪器，最适用于一般开展应用。
【关键词】 肺炎支原体；血清学；金标渗滤；冷凝集；酶联免疫；荧光定量PCR
肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)无细胞壁，最外层为细胞膜，基本形态呈球形或丝形，长约2 μm~5 μｍ，革兰染色阴性，其基因组为环状双链DNA。是儿童肺炎和其他呼吸道感染的重要病因之一。近年来，已成为小儿肺炎常见的病原体［1］，由其引起的呼吸感染日趋增多［2］，MP感染可在任何年龄发生，尤其以5岁～20岁更多见［3］。MP通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，感染后引起MP肺炎，每隔3 a～5 a出现一次地区性流行，占各类肺炎总数的10%～20%，它不但可引起原发性非典型性肺炎，而且可引起全身器官的病变。目前，实验室诊断方法主要依靠血清学。本文对395例小儿肺炎患者进行了冷凝集、酶联免疫法与金标渗滤法查MPAb?IgM、荧光定量PCR法检测MP?DNA的检测比较，结果如下。
1 材料
研究对象为2005年1月至2006年2月在我院儿科住院的肺炎患者395例，男性235例，女性160例，年龄30 d~14岁。按年龄分组：2岁以下患儿87例、3岁~6岁患儿124例、7岁~14岁患儿184例。采集静脉血于枸橼酸钠抗凝管1.0 ml，普通试管3.5 ml。普通试管分离的血清留0.5 ml于带盖的子弹头试管，储于-30℃冰箱集中用酶联免疫法检测MP抗体IgM。冷凝集试验、滴金免疫法测定MP抗体IgM于采血当天检测。荧光PCR法采样咽拭子标本，采集时以清晨为宜。用清水漱口，由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，达咽峡部的病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔黏膜等处，将取样的咽拭子放入0.5 ml无菌的生理盐水中充分漂洗，然后贴壁挤干丢弃，样本-30℃保存后集中检测。
2 方法
2.1 冷凝集试验
血清0.5 ml用0.85%生理盐水作倍比稀释至第9管,第10管用0.5 ml生理盐水作阴性对照管。各加1%红细胞悬液0.5 ml，混匀后置4℃冰箱1 h。取出后立即观察结果。管底红细胞凝集，轻摇不易散开，再放入37℃水浴箱10 min~30 min，凝集消失者为真阳性，并以该管的稀释倍数为效价报告，按1∶32以上或双份效价4倍以上变化者为阳性，提示感染。
2.2 金标渗滤法检测
MPAb?IgM 试剂盒购自兰波生物技术研究所。于效期内按试剂盒说明书进行操作和判断结果。
2.3 酶联免疫法检测
MPAb?IgM 试剂盒购自华美生物技术有限公司，仪器：伯乐1575洗板机、美国宝特EL311S酶标仪。于效期内按试剂盒说明书进行操作和判断结果。
2.4 荧光定量PCR法
MP核酸扩增荧光检测试剂盒购自深圳市匹基生物工程股份有限公司，仪器：大和Line?Gene荧光定量PCR检测仪。样本处理：取样本100 μl加入100 μl DNA提取液，振荡混匀。13 000 rpm离心15 min,吸弃上清液（尽量不碰沉淀物）。加入50 μl DNA提取液2，振荡混匀。100℃干浴10 min,13000 rpm离心10 min，保留上清液备用。PCR反应体系：MPPCR反应液35.6 μl+Taq酶0.4 μl+UNG 0.06 μl+样品裂解物4 μl。循环条件：37℃ 5 min,94℃ 1 min,95℃ 5 s,60℃ 40 s,40个循环，反应体系设40 μl。每次试验均有阴性对照与阳性对照；按说明书操作；试剂有效期内使用。
3 结果
395例小儿肺炎患者MP四种血清学检测结果，见表1。表1 395例小儿肺炎患者MP四种血清学检测结果（略）
从表1中可看出，荧光PCR法检出率最高，酶联免疫法与金标渗滤法次之，冷凝集试验检出率最低。在冷凝集试验检出的115例阳性病例中，有2例其他三种方法都检测为阴性，这可能与检测方法是非特异性有关。金标渗滤法与酶联免疫法检出的阳性标本荧光定量PCR法也都检出。荧光定量PCR法检出的阳性中有1例其他三种方法都检测为阴性，这可能由于生殖支原体感染与MP的感染有血清学的交叉反应从而引起假阳性，也可能是由于污染造成的假阳性。
4 讨论
大量临床资料表明MP是急性呼吸道感染的常见病原体。它可引起呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎、支气管炎乃至肺脓肿、肺大泡及胸膜炎，并且可引起多系统损害［4］。MP已越来越受到人们的关注。MPAb?IgM是机体受MP感染时最早出现的特异性抗体，它于发病后1周左右检出，10 d~30 d达到高峰，12周~16周转阴，检测MPAb?IgM可以早期诊断、早期可明显缩短MP感染病程。
目前，用于检测MP感染的实验诊断方法有MP培养分离、冷凝集试验、酶联免疫法、金标渗滤法及PCR等。相比较而言，培养分离MP虽然对诊断和鉴别有决定性意义，但其检出率较低，在临床上推广应用有困难，冷凝集试验由于是非特异性方法，容易漏检，检出率低，荧光定量PCR虽然检出率高，但操作繁琐，需昂贵设备，不易普及，酶联免疫法检出率虽与PCR法检出率相当，但也需要洗板机、酶标仪设备，而且所需时间较长，只有金标渗滤法无需仪器设备，简便快捷，检出率与酶联免疫法、PCR法相当，最适宜一般开展应用，若同时检测MPAb?IgM和MPAb?IgG则可进一步提高诊断率。
【】
［1］Davis SF.Concurrent outbreaks of pertussis and Mycoplasma pneumonia infection［J］.Clin Infect Dis，1995，20:621.
［2］王学枋，王晓红，赵国吕.小儿肺炎支原体96例临床分析［J］.上海医科大学学报，1997，24（6）:523.
［3］包瑛.肺炎支原体肺炎的研究进展［J］.陕西医学杂志，2002，(10)：35?38.
［4］Chu CS, Braun SR, Yarbro JW,et al.Corticosteroid treat ment of he molytic ane mia associated with mycomplasma pneumoniae pneumonia［J］.South Med J，1990,83(9):1106?1108.
