大规模宫颈细胞涂片实验室染色的质量控制
【摘要】 目的：探讨大规模宫颈细胞学涂片实验室染色的方法和流程。方法：改变传统手工染色的工作流程，创造性改动染色流程，严格按照程序操作，控制好每道程序时间。结果：运用改进后的方法和流程，染色效果优良。结论：在纯手工染色的情况下，能控制好大规模细胞涂片染色效果，一个工作日能制作数千张以上质量较高的宫颈细胞学涂片。
【关键词】 巴氏染色；宫颈细胞涂片；质量控制
宫颈细胞涂片是妇科普查最常用的方法，它对宫颈炎、宫颈糜烂、宫颈前期病变、宫颈肿瘤的诊断简便而有效。我们实验室每年要承担大量的宫颈细胞涂片的染色和读片工作，工作量之大，规模空前，有时还有时间的阶段性。目前我们采用手工染色，采用经典的巴氏染色法，成功解决了因为数量多，无法做好染色质控等问题，现把我们的成熟经验如下。
1 染色原理巴氏（Papanicolaou）
染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液，细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。分化：苏木素染色之后，用水洗去未结合在细胞上的染液，但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去，才能保证细胞核和细胞浆染色的分明，把这个过程成为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，分化不可过度。蓝化：分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色，所以分化之后用水洗除去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水浸洗即可变蓝，也可用温水变蓝。EA 50染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，EA 50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、桔黄等属于酸性染料，在溶媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞浆显蓝色、绿色、桔黄色或红色，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH值而改变的，在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多（带正电），磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力，同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，实际上是一对缓冲剂，可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果，其适用于上皮细胞及间皮组织的标本，是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法，该染色法不但具有显示细胞核结构清晰、分色明显、透明度好、胞浆受色鲜艳等特点，而且所染标本不易脱色，可长久保存。
2 试剂配方
2.1 苏木素染色液的配方 见表1。
表1 苏木素染色液的配方（略）
2.1.1 甲液 苏木素10 g，溶于100 ml无水酒精（水浴加温溶解，50℃左右）
2.1.2 乙液 硫酸铝钾200 g，溶于2 000 ml蒸馏水（电炉加热溶解，至煮沸）
2.1.3 甲液和乙液分别充分溶解后，将甲液缓缓加入乙液，充分煮沸10 min；
2.1.4 两液混合后继续加热至煮沸后，缓慢加入氧化汞5 g，加入氧化汞时，应保持甲乙混合液呈小泡状沸腾；
2.1.5 氧化汞加完后，继续呈小泡状煮沸片刻，迅速将烧瓶移入自来水中冷却降温；
2.1.6 使用前过滤。
2.2 橘黄G的配方
2.2.1 先配10％橘黄G水溶液 10 g橘黄G溶解于100 ml蒸馏水中，存储于深棕色的瓶中，使用前要过滤。
2.2.2 配制橘黄G的染液 见表2。
表2 橘黄G的配方（略）
注：上述各种试剂搅拌溶解即可使用。
2.3 EA50配方 见表3。
2.3.1 先配5％淡绿 称取5 g亮绿溶于5 ml蒸馏水中，然后加入无水酒精至100 ml；
2.3.2 20％伊红 称取20 g伊红溶于20 ml蒸馏水中，然后加入无水酒精至100 ml；
表3 EA50的配方（略）
注：加入磷钨酸后搅拌溶解即可使用。
2.4 1%盐酸分化液 500 ml的95％酒精加入蒸馏水100 ml，再加入浓盐酸6 ml~7 ml，即可使用。
3 染色流程
3.1 染色步骤 将待染色载的玻片先用自来水浸洗1 min~2 min，甩干水滴；放入Harris苏木素液染5 min~8 min后水洗；分化：浸入1%盐酸分化，浸2次~4次（以变成桃红色为适宜），后水洗；蓝化：稀碳酸锂液返蓝（1 min~2 min后在自来水中返蓝或放置在水中5 min以上），或者直接放在温水中（温度在38℃左右）；过两缸95%酒精各1 min；橘黄G 1 min，后依次在两缸95%酒精中漂洗，去掉多余的橘黄；放入EA50染液7 min~8 min；依次在过三缸95%酒精；三缸100%酒精；二甲苯两缸透明各2 min；中性树胶封片。
3.2 注意事项 苏木素每天要过滤，染色前捞去上层结晶，染色时要轻拿轻放，注意温度及染色液的使用程度，调整染色时间，对使用过度的苏木素染液要及时更换；在橘黄液中不宜过长，否则影响EA50的着色；EA50用前要搅拌，操作时要注意上下提拿染色架，对温度也有一定的要求。一般在25℃左右的室温中；保持各染色液浓度，及时更换，固定效果不佳影响染色。脱水不彻底，影响胞浆染色；技术人员操作要流畅，动作干净利落，不可把上一缸的染色液带入下一缸，每缸交替时要甩干玻片上残存的液体；染色技术人员要每日做好记录和染色更换时间，做好卫生工作，并认真研究诊断人员反映的染色意见，对常用试剂要早做准备，以免使用时出现染液不足；应对大量标本，我们在实际工作中，使用两缸苏木素，两缸橘黄G，两缸EA50染液，利用每缸染色的时间差，同时操作，可大大提高工作效率。
4 染色效果
上皮细胞：核呈深蓝色或深紫色，核仁红色，胞浆粉红色或蓝绿色；红细胞：鲜红色；白细胞：细胞淡蓝色而核深蓝黑色；细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；黏液：淡蓝色或粉红色；核深蓝色,鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞浆染绿色，表层不全角化细胞胞浆染粉红色, 完全角化细胞胞浆呈桔黄色, 红细胞染鲜红色，黏液染淡蓝色或粉红色。通过近1年的应用，我们深刻体会到巴氏染色应用宫颈细胞学染色的优点，细胞透明度好，细胞结构清晰，给镜下读片带来很多便利，涂片色彩丰富而鲜艳，同时还可以观察女性激素水平，镜下细胞形态跟年龄不符时，可以帮助诊断女性激素水平的高低，但我们也发现，试剂配制和操作比较繁杂，费用较高，染液易陈旧,而且和市场上的染料质量有很大的关系，而导致染色效果不稳定, 我们实验室所用试剂由广东著名西陇化工提供全面的技术支持和帮助。EA50染液配方稍复杂, 但不易沉淀，染色效果较EA36稳定。染色质量不及苏木素伊红法稳定，在基层医疗单位推广较困难，新配制的染液，淡绿最容易着色，所有的细胞和核都染成绿色，染液使用久后，细胞均染成棕灰色，涂片中黏液较多时或涂片较厚，染液的渗透性较差，细胞不易着色。大规模宫颈细胞涂片工作量大，染色任务繁重，目前的自动染色机还不能满足我们的工作要求，手工染色显得尤为重要，而人的责任心和工作态度是做好染色工作的关键点，染色的好坏直接影响到读片的质量，所以我们必须严格按照每个步骤的要求进行操作。
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［1］ 上海市肿瘤病理科.实用肿瘤细胞学［M］.1975.
［2］ 病技术［M］.第1版.人民卫生出版社，2000：95?134,954?960.
［3］ 诊断细胞病理学［M］.第1版.河南技术出版社，2000：789?814.
