微板赖氏法酶标仪点对点定量测定丙氨酸氨基转移酶活力

【关键词】  丙氨酸氨基转移酶；无偿献血；微板赖氏法

　　丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定，是对无偿献血者及大量体检时不可缺少的项目之一。目前大多还是采用赖氏试管法来测定，笔者利用酶标仪点对点数据处理系统来建立标准曲线，用微板赖氏法进行测定，既省工、省试剂，也利于原始数据的归档管理，现介绍如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器  MK?2型酶标仪；微量加样器；1011型半自动生化分析仪；96孔平底微孔板、电热恒温水温箱、定时针。

　　1.2  试剂  ALT赖氏法试剂（上海荣盛生物试剂厂）。ALT定值血清：x=31.5（购自北京九强公司）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  建立标准曲线  按下表加样，每管平行做3份。各加入2,4?二硝基苯肼液50 μl充分混匀，在电热恒温水温箱中37℃温育20 min后，各管加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混匀，静置10 min，在酶标仪上选择基础酶联模式，测量模式以测定波长492 nm，波长630 nm，以“0”号管为空白管，方式利用点对点（Point to Point）数据处理程序来建立标准曲线并用（SAVE）键保存，依次输入酶活力单位值，平行份数及位置，然后确定，按“Start”键测定，系统自动根据不同酶活力单位与对应的平均A值建立标准曲线。经过分析认为曲线良好，然后按“SAVE”键，选择一个序号将其保存。注意下次建立标准曲线时，可以按上述步骤建立，也可以直接利用“SAVE”键调出原来的标准曲线序号，按“Start”选择建立新标准曲线模式来自动建立。

　　1.3.2  标本测定  在微板上设A1为空白孔，加10 μl磷酸盐缓冲液，50 μl基质液；测定孔加标本10 μl，然后分别加入50 μl基质液，充分混匀，然后再在37℃温育30 min后每孔加入2,4?二硝基苯肼50 μl，混匀，37℃温育20 min，每孔加入0.8 mol/L NaOH溶液200 μl，充分混匀室温静置10 min后，在酶标仪基础酶联模式下按“SAVE”键选择序号，调出保存的标准曲线，按“Start”选择“利用旧标准曲线测量模式”直接进行测定，结果ALT酶活力单位直接被打印出来。

　　1.3.3  微板赖氏法点对点测定的准确性估计  从本中心血库无偿献血者标本中随机抽取20份标本，分析用微板赖氏法酶标仪点对点和试管赖氏法来测定ALT，将结果做配对资料t检验，借以估计二者是否存在显著差异，间接评估其准确性。

　　表1  点对点测定的准确性估计（略）

　　1.3.4  微板赖氏法酶标仪点对点测定ALT的精密度估计  在每天日常检验工作中，每天加检一份ALT定值质控血清样品，采用微板赖氏法酶标仪点对点法和试管赖氏法测定ALT，连续20次，计算其标准差与变异系数，判断其精密度。

　　1.3.5  微板赖氏法酶标仪点对点测定ALT重复性估计  从微板赖氏法酶标仪测定的无偿献血者1 390人中，随机抽取25份标本，重复测定，2次结果做配对差值统计分析，判断其重复性。

　　2  结果

　　20份随机抽取的标本，微板法与试管法做对照（表2），经成对资料t检验，t=0.481，P＞0.05微板法与试管法无差异，与张根仓等结果一致［1］。微板法测定20份质控血清，其均值=30.9，s=2.0，CV=7%。试管法测定20份质控血清，其均值=32.4，s=2.9，CV=9%。微板法测定无偿献血者1 390人，ALT不合格50人，不合格率为3.5%。随机抽取25份标本重复测定，两次结果经配对差值统计分析（n=25），d=0.275，s=4.32，t=0.318 ，P＞0.05，说明重复性较好。

　　3  讨论

　　试管法与微板法同测随机抽取的20份标本，经配对资料t检验结果差异无显著性，用微板法测定20份质控血清，CV为7%，说明微板法ALT检测结果的精密度合乎要求，重复测定25份标本，2次结果经配对差值分析重复性较好。证明采供血机构日常采用该方法检测血样ALT符合要求。赖氏法测定ALT时由于底物浓度的明显不足使得酶促反应产生丙酮酸的量与酶活性间不能呈现良好的线性关系。因此，笔者认为利用标准曲线测定ALT比张根仓［1］用一点标准测定ALT更能准确地反映酶的活力，而且线性范围比较宽，特别是对25 μ/L临界值测定的准确性较高，更利于对无偿献血者ALT的筛检测定（无偿献血者以ALT＜25%为合格）。注意每换一批试剂，均应重作标准曲线。高测定波长49.2 nm，波长630 nm用双波长测定可以克服轻度脂血等多种因素的干扰，因为轻度脂血在492 nm与630 nm处吸收值接近，而欲测成分丙酮酸在该双波长处吸收值差异有显著性，从而最大限度地去掉轻度脂血带来的影响。刘玉振［2］等已讨论过，微板赖氏法是对点测定ALT，由于酶标仪可以在2 s内快速读取96份测定标本的A值并能由预先测定的标准曲线将ALT结果直接出来，因此可以改善标准赖氏法ALT检测效率低下的状况，但酶标仪仅有几个固定波长的滤光片，因此必须挑选适合酶标仪检测ALT的波长，以保证读取结果的准确性，一般选用波长492 nm的滤光片为佳，实验证明两种波长下的检测结果非常吻合。建议有条件的话测定波长用510 nm为好（大多酶标仪没有510 nm），可以使脂血、溶血对实验结果影响更小，尽管如此，严重脂血标本应做对照克服，溶血标本应重新采集。

　　表2  两种方法检测结果比较（略）

　　ALT的检测关键在于精确的加样和温度控制，把赖氏法缩小10倍于微板中进行，从理论上来说加样的误差、温育时间、温度的误差引起的检测结果误差将会增大。因此，要定期校正加样器，检测恒温水温箱的温度，使仪器处于最佳状态。每加一种试剂均应充分混匀，特别是NaOH加完后和测量前要震荡混匀。微板法由于孔间差异较小，受热均匀，易混匀，且酶标仪测量速度快2 s内可以同时测定96孔，减少了测量带来的误差，因此，其重复性较好，而且ALT的检测结果可以像酶免实验一样贮存并打印出原始记录，便于资料的保存，实现所有检测项目标准化管理。如果是全自动酶免分析仪，其精确的加样和温度控制将弥补人工加样及温度时间方面的不足，避免了人工加样造成的误差，准确性和重复性将更理想，并将ALT的检测纳入到全自动检测系统，便于检验科工作的安排，节省人员，提高检验工作的自动化程度。

【参考】
  　　［1］ 张根仓，刘爱绒，李彦芳，等.输血杂志，2001,14(2):82.

　　［2］ 刘玉振，陶玉生，温涛，等.中国输血杂志，2000,13(1):29.