白三烯受体基因mRNA在慢性阻塞性肺疾病患者中的不同表达

【摘要】  目的：评价慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的白三烯受体(LTs?R)基因的表达；对比LTs?R基因mRNA在COPD组和健康对照组之间表达水平的差异；研究COPD缓解期患者与急性发作期患者的LTs?R基因mRNA表达水平是否存在差异。方法：通过LT1?R和LT2?R特异性引物对59份试验者的血液标本，应用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术检测LT1?R和LT2?R的表达。引入内参β?actin，应用电泳凝胶定位分析仪，1 D凝胶分析软件，对比并定量分析LT1?R和LT2?R基因mRNA在COPD患者和对照健康者之间的表达差异，对所得数据进行统计学分析、处理和评价。结果：所有COPD患者的标本均检测到编码LT1?R 和LT2?R 基因的mRNA 表达，且与正常组对比差异有显著性（P<0.05），但缓解期组与急性加重期组之间差异无显著性（P>0.05）。结论： LT1?R和LT2?R基因mRNA在COPD者外周血白细胞中表达水平显著增高；但缓解期组与急性加重期组患者的表达水平之间无明显差别。

【关键词】  白三烯受体;慢性阻塞性肺疾病；急性发作期；缓解期

　　慢性阻塞性肺疾病（COPD）是包括慢性支气管炎和肺气肿的一组疾病，其特点为均具有气流阻塞并缓慢进行性，部分有可逆性，可伴有气道的高反应性［1］。白三烯（leukotriences, LTs）是花生四烯酸通过脂氧酶代谢途径形成的，与COPD的气道炎症反应有密切的关系，而白三烯受体(LTs?R)在COPD患者上气道中的表达研究较少。考虑到LTs在人上气道炎症中作为介质的重要作用［2］，本文旨在探讨COPD患者外周血中的LTs?R的表达情况。

　　1  对象和方法

　　1.1  研究对象  分为三组，正常对照组、COPD缓解期组、COPD急性加重期组。

　　1.1.1  正常对照组  健康志愿者20例，年龄50岁～72岁；男性12例，女性8例。

　　1.1.2  COPD缓解期组  COPD缓解期患者22例，男性13例，女性9例；年龄51岁～77岁；均为COPD缓解期，达3个月以上。

　　1.1.3  COPD急性加重期组  COPD急性加重期患者17例，来自于我院2006年9月以来住院患者，年龄48岁～75岁；男性10例，女性7例。所有COPD患者均符合中华医学会呼吸病学分会《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》的诊断标准，病程在5 a～20 a之间。所有参与试验者均排除以下情况：严重肝、肾功能不全，严重心、脑、血管及血液系统疾病，免疫系统疾病及肿瘤，6周内使用过抗生素，有哮喘及变态反应性鼻炎或其他变态反应性疾病史， 1年内接受过皮质类固醇或LT 调节剂。所有参与者均签订知情同意书。

　　1.2  研究方法

　　1.2．1  外周血淋巴细胞提取  所有参与者于清晨（空腹8 h以上）取外周静脉血5 ml，抗凝管4 ℃保存，并于20 min内进行下一步处理。将上述血液转移至20 ml离心管中，2 000 r/min,离心15 min，弃上层血浆，留下层血细胞。加入同等体积的RPMI 1640混匀，轻轻加入含5 ml人淋巴细胞分离液于离心管中，使血液与淋巴细胞分离液清晰分层；2 400 r/min,离心15 min，可见分层；吸取中间层的PBMC，置于离心管中，加入等体积RPMI 1640，2 000 r/min,离心15 min；弃去上清，加入3 ml RPMI 1640，轻轻吹打沉淀；2 000 r/min,离心15 min，吸去上清；沉淀即为淋巴细胞。

　　1.2．2  用TRIzol法一步分离细胞总RNA  淋巴细胞用TRIzol (Invitrogen)试剂按照公司操作指南抽提总RNA，分离的总RNA通过分光光度计 (model DU?530; Beckman) 进行定量测定。

　　1.2．3  逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)获得目的基因  总RNA根据指导手册以随机引物和逆转录酶 (Superscript II ?ReverseTranscriptase; Invitrogen) 逆转录成cDNA。测定LT1?R、LT2?R 和β?actin的PCR 引物［3］。LT1?R的引物：上游引物5'?TTATGTTCACAAAGGCATTTGG?3'；下游引物5'?GCTCATGGCTGTCATAAAGAA?3';LT2?R的引物：上游引物5'ACTATATTGCCTTGGTGGTGGG?3'；下游引物5'?ATGATGGTGGTCAGTGCCTTC?3'；β?actin的引物：上游引物5'?GACTACCTCATGAAGATCCTCACC?3'；下游引物5'?TCTCCTTAATGTCACGCACGATT ?3'。每个反应体系为25 μl，包含2.5 μl缓冲液(10)，6 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L三磷酸去氧核苷，0.6 μmol/L引物，0.25 μl Taq DNA 聚合酶 (SureStart;Stratagene)和2 μl cDNA。PCR循环条件如下：LT1?R：预变性94 ℃ 5 min进入循环，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共33个循环，最后72 ℃延伸5 min；LT2?R：预变性94 ℃ 5 min进入循环，94 ℃变性30 s，54.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共33个循环，最后72 ℃延伸5 min；β?actin：预变性94 ℃ 2 min进入循环，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环，最后72 ℃延伸5 min。

　　1.2．4  琼脂糖凝胶电泳  应用电冰凝胶定位呈像分析仪对电泳后的凝胶进行不同程度的曝光摄影。运用1D凝胶分析软件对电泳结果进行数据分析，获取两种产物量的比值：LT1?R／β?actin，LT2?R／β?actin。

　　1.2．5  统计学方法  应用SAS 6．12统计学分析软件，对数据资料进行方差分析。

　　2  结果

　　由于β?actin在人体中的表达是基本恒定的，以β?actin为内参对照，对待测产物进行半定量分析。LTs?R基因mRNA在正常对照组、COPD缓解期组以及COPD急性加重期组中均存在表达。COPD急性加重期组LTs?R基因表达水平高于COPD缓解期组，但是差异无显著性（P>0．05）；而COPD急性加重期组、COPD缓解期组分别与正常对照组比较，表达水平明显升高，且差异均具有显著性(P均<0．05)。

　　表1  LT?R基因mRNA表达水平比较（略）

　　3  讨论

　　LTs是重要的炎性介质。COPD是存在不完全可逆性的气流受限性疾病,其气流受限存在进行性和伴肺部炎症的特性。近年来的研究提示COPD亦是一种慢性气道非特异性炎性疾病,部分患者具有气道高反应性［4］。LTs作为强有力的炎症介质与慢性气道炎性疾病有密切关系［5］。LTs通过作用于特异性的LTs?R受体，引起呼吸系统气道平滑肌收缩,增加气道血管通透性导致水肿，气道黏液分泌增加，增加气道血浆渗出。1999年，两个不同的研究组均报道了LT1?R［6］，2000年，LT2?R的性质及特征亦被研究阐述［7］。本实验运用了RT?PCR分子生物学技术，在COPD及正常对照组患者的外周血白细胞中提取LTs受体的基因片断，并通过内参对照β?actin进行半定量分析。所得数据提示：COPD患者的LTs?R的表达明显高于正常对照组，但是缓解期与急性加重期之间差异无显著性。LT1?R基因位于人类Xql3?21，为G?蛋白耦联受体，是有7个跨膜的A螺旋蛋白，机上的分子量为38549［8］。LT2?R基因位于人类l3q14，该区域与特应性哮喘相关联，该观点已被美国和日本的两大实验室研究并证实。LT2?R为G蛋白耦联受体，通过细胞内Ca升高发挥其生物学效应。本实验表明：COPD LTS受体基因的表达明显高于正常对照组，但COPD的急性发作对于LTS受体基因的表达并无明显的影响，为COPD提供了药物遗传学的新途径。

【】
  　　［1］ 王吉耀.内［M］.北京：人民卫生出版社，2002：30.

　　［2］ Borish L. Ann Allergy Asthma Immunol［J］.2002，88:16?22.

　　［3］ K. Shindo. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids［J］.1997，56(3)：213?217.

　　［4］ MitsunobuF,MifuneT,HosakiY, et al. Enhanced production of leukotrienes by peripheral leukocytes and specific IgE antibodiesin patients with chronic obstructive pulmonary disease［J］.J Allergy Clin Immunol,2001，107:4922498.

　　［5］ Birke FW,Meade CJ,Anderskewitz R, et al.In vitro and invivo pharmacological characterization of BIIL284,a novel and potent leukotriene B4 receptor antagonist［J］. J Pharmacol Exp Ther,2001，297:458?466.

　　［6］ Joos L， Sandf0rd AJ．Genotype predictors of response to asthma medications［J］. Curt Opin Pulm Med，2002，8(1)：9.

　　［7］ Christopher EH．Charcterization of the human Cystein： Leukotriene 2 Receptor［J］．The Journal Chemistry，2000，39：275.

　　［8］ Yokomizo T,Izumi T,Chang K, et al. A G?protein?coupled recepto tor leukotriene B4 that mediates chemotaxis［J］.Nature,1997，387：620?624.