宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析
【摘要】 FHIT基因是一种与凋亡有关的肿瘤抑制基因，广泛存在于各种细胞凋亡系统中，在多种肿瘤及细胞系中失活，其启动子部位CpG岛甲基化是FHIT基因失活的主要机制之一。本研究应用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR，MSP)对不同宫颈鳞癌细胞系FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态进行检测，在分子水平上了解FHIT异常甲基化与宫颈癌的相关性，为宫颈癌去甲基化提供依据。
【关键词】 宫颈癌；FHIT基因；甲基化PCR
Detection of Methylation of the FHIT Promoter 5'?CpG in Human Cervical Cancer Cell Lines
Abstract：The 5'CpG island methylation of FHIT gene has been detected in many carcinomas， and it maybe aroses inactivation on FHIT gene.Such little details on methylation status of 5'?CpG island of FHIT gene in cervical cancer cell were reported， so this study was designed to explore methylation status of 5'?CpG island of FHIT gene in 6 cervical cancer cell lines. We want to reveal the relationship between FHIT gene and tumourigensis and/or development in human cervical cancer.
Key words：Cervical Cancer；Fragile histidine triad (FHIT)gene；Methylation?specific polymerase chain reaction (MSP)
国内外有关宫颈癌与FHIT基因启动子区甲基化的研究报道不多，结论尚不一致。Herman［1］等1996年建立的异常甲基化检测方法(MSP)具有灵敏度高、特异性好、操作简便的特点。本研究拟应用MSP技术分析人宫颈癌细胞株FHIT基因5'端CpG岛甲基化水平，旨在揭示FHIT基因甲基化对人宫颈癌发生的影响，为寻找宫颈癌诊断和治疗的新方法提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1．1 材料 SiHa、C4?1、Hela、RJC?1、CS1213以及C33A细胞株为西安大学第一附属临床分子生物学中心保存。
1.2 主要试剂 RPMI Medium 1640为美国GIBCO公司产品；热启动Taq酶、Hae Ⅲdigest DNA Marker购于日本Takara公司；亚硫酸氢钠、氢鲲购于美国Sigma公司。FHIT甲基化扩增引物序列:F5_?TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC?3；R 5_?CGTAAACGACGCCGACCCCACTA?3，扩增产物长度为74ｂｐ；非甲基化扩增引物序列扩增产物长度为F 5_?TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG?3；5_?CATAAACAACACCAACCCCACTA?3；两组引物由上海生工生物公司合成。
1.3 方法
1.3.1 提取样品 常规细胞复苏、传代、收集细胞，-70℃保存。Qiagen DNeasy Tissue kit提取细胞基因组的DNA。取2 μl DNA样品加入98 μl TE缓冲液稀释，经核酸蛋白分析仪测定260 nm和280 nm处的吸光度，若比值在1.8～2.0之间，说明样品中的核酸较纯。
1.3.2 亚硫酸氢盐修饰 双蒸水稀释2 μg DNA至10 μl，加入3 mol/L NaOH 1.1 μl混匀；37 ℃水浴170 min～20 min；加入10 mmol/L氢鲲6 μl，轻轻摇匀；加入3.6 mol/L亚硫酸氢钠（pH 5.0）104 μl，轻轻混匀；至于PCR仪中， 55 ℃温浴18 h(过夜)；置于-20 ℃保存。
1.3.3 PCR反应及产物检测 94℃ 3 min、94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 30 s、40个循环、72℃延伸7 min。取5 μl PCR产物与1 μl 6 Loading Buffer混合，上2％琼脂糖凝胶（0.5TBE），90 V电泳20 min，并以作为分子量参照标准进行产物鉴定，凝胶成像分析系统分析并照相。
2 结果
6个宫颈癌细胞株中，SiHa、C4?1、Hela 、C33A甲基特异性引物和非甲基特异性引物均扩增扩增出73 bp的目的条带，呈现出甲基化杂合性状态，而RJC?1、CS 1213细胞仅甲基化引物扩增出了目的条带，非甲基化引物未扩增出目的条带，表现为完全甲基化状态。
3 讨论
引起基因表达异常主要有遗传学和表遗传学两种机制。后者可以通过基因甲基化而发生，是指DNA的CpG岛中胞嘧啶被甲基基团修饰，这是DNA在转录水平上的修饰方式之一。DNA甲基化改变不仅可以直接或间接影响基因转录，也可通过5?甲基胞嘧啶脱氨基诱发胞嘧啶转变为胸腺嘧啶， 引起基因异常表达， 还可引起染色体结构改变， 导致基因表达不稳定。正常宫颈组织、癌前病变和宫颈癌组织FHIT基因DNA甲基化状态并不相同［3］，表明DNA甲基化状态可能直接与宫颈癌进展有关。本研究运用MSP 法检测宫颈癌细胞株FHIT基因甲基化状态，发现不同宫颈癌细胞株FHIT基因甲基化模式不完全相同，而不同的宫颈癌细胞株在生物学特征有很大差异。因此，FHIT基因可能在宫颈癌发生和过程中扮演重要角色。由于很多研究都表明抑癌基因启动子异常甲基化是肿瘤形成过程中的一个早期、频发事件， 广泛存在于所有种类的人类肿瘤中，基因启动子因异常甲基化是一个高灵敏度的肿瘤生物标志物，因此对其结构状态的检测可为临床提供相应的肿瘤发生的信息。根据FHIT基因甲基化率在正常宫颈组织和宫颈癌组织中差异有显著性，且随病理分级进展而增高［4］，故有可能通过检测FHIT基因甲基化率对于宫颈瘤进行诊断，若能在宫颈癌患者的血清中检测到FHIT基因的甲基化，就可将FHIT基因甲基化作为肿瘤标记物，应用于高危人群的监测与评估、效果的观察判定等。
【】
［1］ Herman J G， Myohanen S， Nelkin B D， Baylin S B，et al. Methylation?specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci USA［J］.1996， 93:9821?9826.
［2］ Adriana D C， Angelina M， Simonetta D R，et al.DNA demethylation is directly related to tumour progression: evidence in normal， pre?malignant and malignant cells from uterine cervix samples. Oncolog Reports［J］.2003，10:545?549.
［3］ 史惠蓉，吴庆华，索振河.宫颈癌组织中FHIT基因5'端CpG岛甲基化及其与基因失活的关系［J］.癌症，2005，24 (1):7?11.
