白藜芦醇对鼻咽癌相关实验模型的整体与离体药理作用研究

　　　　　　　作者：文炳均，黄碧云，何展祥，吴树浓，黎连新，石胜，吴波

【摘要】  目的：了解白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE?2 Z凋亡过程中半胱天冬酶?6(caspase?6)的活化情况。方法：采用实时PCR检测caspase?6 mRNA表达的改变，比色法测定caspase?6活性的变化。结果：采用不同浓度的白藜芦醇(0 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L、240 μmol/L)处理小鼠鼻咽癌细胞24 h，caspase?6 mRNA的表达呈浓度依赖性的增加(P＜0．01)；caspase?6活性呈浓度和时间依赖性的升高(P＜0．01)。结论：白藜芦醇诱导小鼠鼻咽癌细胞CNE?2 Z凋亡过程中存在caspaso?6的活化。

【关键词】  白藜芦醇；细胞凋亡；鼻咽癌细胞；半胱天冬酶

　　Studies on the Pharmacologic Mechanism of Resveratrol on Rats with Nasopharyngeal Carcinoma

　　Abstract:Objective To investigate whether caspase?6 was activated during resveratrol-induced apoptosis of rats'nasopharyngeal carcinoma cells CNE?2Z.Methods The changes of caspase?6 mRNA was detected by semi-quantitative RT?PCR.The changes of caspase?6 activity was determined by colorimetric assay.Results After CNE?2Z cells were treated with 0 μmol/L，30 μmol/L，60 μmol/L，120 μmol/L，240 μmol/L resveratrol for 24 hours，respectively，the expression of caspsae?6 mRNA was increased in a concentration-dependent manner(P<0.01).The caspase?6 activity was increased in a concentration and time-dependent manner(P<0.01).Conclusion Caspase?6 is activated during resveratrol-induced apoptosis of CNE?2Z cells.

　　Key words:Resveratrol;Apoptosis;Nasopharyngeal carcinoma cells;Caspase

　　白藜芦醇为多酚类物质，是葡萄属植物产生的一种植物抗毒素，结构类似于雌激素乙底酚。白藜芦醇在植物中分布很广，含量较高，目前至少已经在70余种植物中发现了白藜芦醇。随着对白藜芦醇研究的深入，人们发现它具有多种药理活性，包括抗氧化活性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样活性、生长抑制活性、免疫调节及抗肿瘤活性等。近年来的研究［1～3］还发现：白藜芦醇可诱导人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE?2 Z凋亡，且其凋亡过程中有caspase?3的参与。本文将进一步探讨白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE?2 Z凋亡过程中是否有caspase?6的活化，对caspase?6 mRNA的表达及其活性变化进行了分析，现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1．1  材料  实验用鼻咽癌大鼠27只(3月龄同系)，体重(235±17)g，雌雄不拘，全部由中山大学实验动物中心提供；白藜芦醇为Sigma公司产品，使用前用DMSO溶解配成240 mmol/L；caspase?6多克隆抗体为Santa Cruz公司产品； caspase?6抑制剂VEID-fmk为Clontech公司产品；caspase?6底物AC?VEID-pNA为Alexis公司产品；9600型基因扩增仪为PE公司产品；ELx 800型酶标免疫测定仪由Bio?Tek公司生产；RT?PCR试剂盒由中山大学达安基因股份有限公司提供。

　　1.2  方法

　　1．2．1  RT?PCR检测caspase?6 mRNA的表达  总RNA的提取：分别收集白藜芦醇0 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L、240 μmol/L处理24 h的鼻咽癌大鼠CNE?2 Z细胞，严格按操作规程提取总RNA；引物的设计与合成：引物设计采用软件Primer Express 2．0进行，其Forward primer为5’-CCATGGCGAAGGCAATCA-3’，Reverse primer为5’-CTCCAGCAGGCAGCGTGTAA-3’，以β?actin为内参物，其Forward primer为5’-TCCTGTGGATCCACGAAACT-3’，Reverse primer为GAAGCATTTGCGGTGGACCAT-3’，由中山大学达安基因股份有限公司采用ABI 3900台式高温量DNA合成仪合成。扩增条件：49℃逆转录43 min，95℃预变性2 min，循环30次(94℃ 30 s，52℃ 1 min，68℃ 2 min)，再68℃充分延伸8 min。

　　1．2．2  比色法caspaso?6活性的测定  将鼻咽癌大鼠细胞分为三组：对照组(未经药物和抑制剂处理的CNE?2 Z细胞)；白藜芦醇组(用白藜芦醇30 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L、240 μmol/L处理24 h的CNE?2 Z细胞及120 μmol/L白藜芦醇处理4 h、8 h、12 h、24 h、48 h的CNE?2 Z细胞)；VEID-fmk+白藜芦醇组(先用120 μmol/L VEID?fmk预处理2 h后，再用白藜芦醇处理的CNE?2 Z细胞)，各组均设3复管。分别收集三组细胞，参照［4］处理后，加入caspase?6的底物AC-VEID-pNA，使其最终浓度为60 μmol/L。置37℃孵育60 min，转移到96孔板中，在405 nm下测定其吸光度来表示caspase?6的相对活性。

　　1．2.3  统计学处理  采用SPSS 11．0进行统计学处理，组间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2．1  caspase?6 mRNA的表达  分别采用白藜芦醇0 μmol／L 、30 μmol／L、60 μmol／L、120 μmol／L、240 μmol／L处理CNE?2 Z细胞24 h，caspase?6 mRNA的条带逐渐变粗、变亮；图像分析结果也显示caspase?6／β?actin(内参物)的光密度积分值之比有随浓度增加而增高的趋势，具有浓度依赖性(P＜0．01，见图1)。

　　图1  Caspase?6 mRNA水平变化的图像分析结果（略）

　　(注：与对照组相比，*：P＜0．01)

　　2．2  caspase?6活性的变化  用白藜芦醇120 μmol/L处理CNE?2 Z细胞4 h、8 h、12 h、16 h、24 h、48 h，caspase?6的相对活性测定结果见表1。从表1可见caspase?6的活性随处理时间的延长而不同，具有时间依赖性(P＜0．01)。 caspase?6的活性在用白藜芦醇处理后8 h开始升高(与对照组、 VEID-fmk+白藜芦醇组两组比较， P<0.01)， 16 h达高峰(约为对照组的5倍， P＜0．01)。 以后呈缓慢下降， 至48 h才降至对照组水平(P>0．05)  。 用白藜芦醇0 μmol／L 、 30 μmol／L 、 60 μmol／L、120 μmol／L、 240 μmol／L处理细胞后16 h，各浓度组caspase?6的相对活性见图2，从图2可见caspase?6活性有随浓度增加而增高的趋势，具有浓度依赖性(P<0.01)。

　　表1  白藜芦醇120 μmol/L处理后不同时间caspase?6相对活性的检测结果(A405 nm)（略）

　　注：与其他两组相比，*：P＜0．01。

　　图2  不同浓度白藜芦醇处理后16 h caspase?6相对活性的检测结果（略）

　　(注：与对照组相比，**：P＜0．05，**：P＜0．01)

　　3  讨论

　　白藜芦醇化学名为芪三酚(3，4，5-trihydroxystibene)，是一种天然活性成分，目前已在葡萄、决明、藜芦、虎杖等21个科、31个属的72种植物中发现，较早证实其有抗菌、抗炎、抗血栓、抗脂质过氧化等功效，近年还发现其有抗癌活性。在对其抗癌机制研究中，已发现白藜芦醇可通过诱导多种肿瘤细胞株凋亡而抑制其增殖［5，6］。细胞凋亡信号传导的关键是caspase的激活，所有的caspase正常时均以无活性的酶原形式存在，当受到凋亡信号的刺激时，切割形成一个大亚基和一个小亚基，然后结合成α2β2四聚体，从而形成有活性的caspase。caspase通过有序的依次切割而被激活，产生级联反应，最终诱导细胞凋亡。迄今已发现caspase家族有16个成员，据caspase在级联反应中的作用和活化的先后，分为启动性和效应性caspase，caspase?6属效应性caspase。近年来研究发现，白藜芦醇诱导一些肿瘤细胞凋亡中也有caspase?6的参与。因此，caspase?6在一些肿瘤细胞(包括鼻咽癌细胞)凋亡过程中起重要作用。本研究采用不同浓度白藜芦醇处理CNE?2 Z细胞24 h，采用半定量RT?PCR发现白藜芦醇浓度依赖性地增加caspase?6 mRNA的表达；同时通过caspase?6活性的检测，发现caspase?6的活性呈浓度和时间依赖性的升高。因此，从caspase?6的转录和活性检测结果均证实，在白藜芦醇诱导大鼠鼻咽癌细胞CNE?2 Z细胞凋亡的过程中有caspase?6的活化。

【】
  　　［1］ Ai Shih，Shenli Zhang，H．James Cao，et al．Inhibitory effect of epidermal growth factor on resveratrol-induced apoptosis in prostate cancer cells is mediated by protein kinase C-α［J］．Mol．Cancer Ther，Nov 2004，3：1355?1364．

　　［2］ Sheng?Hong Tseng，Swei?Ming Lin，Jin?Cherng Chen，et al．Resveratrol Suppresses the Angiogenesis and Tumor Growth of Gllomas in Rats［J］．Clin．Cancer Res，Mar 2004，10：2190?2202.

　　［3］ 唐旭东，周克元，赵南.白藜芦醇对鼻咽癌细胞株CNE?2Z增殖和凋亡的影响［J］.中草药，2004，35(3)：287?290.

　　［4］ Grub S，Pcrsohn E，Trommer W E，et al.Mechanisms of cyclosporine A-induced apoptosis in rat hepatocyte primary cultures［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2000，163(3):209.

　　［5］ Dominique Delmas，Cedric Rebe，Sandrine Lacour，et al.Resveratrol-induced Apoptosis Is Associated with Fas Redistribution in the Rafts and the Formation of a Death-inducing Signaling Complex in Colon Cancer Cells［J］.J.Biol.Chem，Oct 2003，278:41482?41490.

　　［6］ Sunita B.Jones，Samuel E，et al.Resveratrol-Induced Gene Expression Profiles in Human Prostate Cancer Cells［J］.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev，Mar 2005，14:596?604.