10-0尼龙线携载TGF?β2反义寡核苷酸的实验研究

【摘要】  目的：探讨10-0尼龙线携载TGF?β2反义寡核苷酸的的可能性。方法：将10-0尼龙线反复浸泡于TGF?β2反义寡核苷酸溶液中24 h、48 h、72 h，溴化已锭(EB)标记后紫外透射分析仪下观察其吸附TGF?β2反义寡核苷酸情况，并将浸泡的缝线置于生理盐水中水浴，在不同的时间点取溶液用紫外分光光度计测其吸光度A值，进一步观察缝线携载TGF?β2反义寡核苷酸情况。结果：浸泡于TGF?β2反义寡核苷酸溶液中的10-0尼龙线经溴化已锭标记后紫外透射分析仪下不显色，各时间点缝线的水浴液A值与对照组差异无显著性。结论：10-0尼龙线不能携载TGF?β2反义寡核苷酸。
　　

【关键词】  缝线；反义寡核苷酸；瘢痕

　　The Study of 10-0 nylon Carrying TGF?β2 Antisense Oligodeoxynucleotide 
 　　
　　Abstract：Objective To investigate the possibility of 10-0 nylon suture carrying TGF?β2 anti?sense oligodeoxynucleotide. Methods The 10-0 nylon suture were soaked in TGF?β2 anti?sense oligodeoxynucleotide solution repeatedly for 24 h、48 h、72 h.Then the soaked suture were labeled with EB solution and observed under an ultraviolet lamp; the soaked 10-0 nylon suture were emerged in normal saline and the value of absorbance (A) was measured by ultraviolet spectrophotometer at different time points. Results The suture labeled with EB did not show color. The value of absorbance (A) of soaked suture had no difference with control group. Conclusion The 10-0 nylon suture can not carry TGF?β2 anti?sense oligodeoxynucleotide.
　　
　　key words： Suture; Anti?sense oligodeoxynucleotide; Scar
   
　　青光眼是一种常见的致盲眼病，目前仍以手术为主，但青光眼滤过术后常常由于滤过通道瘢痕化而导致手术失败。据报道，青光眼滤过术后2年内复发率为15%～30%［1］。如何减少青光眼术后滤过通道的瘢痕化是提高手术成功率的有效途径，目前从分子水平上抑制滤过通道的瘢痕化表现出良好的应用前景，但反义寡核苷酸治疗的关键是如何提高转染效率和避免全身副作用［2］。曲乐丰等［3］研究发现8?青光眼是一种常见的致盲眼病，目前仍以手术治疗为主，但青光眼滤过术8?0薇乔缝线可携载c?myc反义基因，因眼科临床多用10-0尼龙线，若10-0尼龙线能携载反义基因片断，可为眼科术后减少瘢痕提供一个新的思路。本研究旨在探讨10-0尼龙线携载TGF?β2反义寡核苷酸的的可能性，现将结果报告如下。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要试剂和器材  10-0尼龙线：美国强生公司提供；TGF?β2反义寡核苷酸：根据兔TGF?β2 mRNA序列(Genbank号AY429466)，由上海生工生物技术有限公司合成，21bp(序列为：3‘AGAAGTTGGCATTATACCCTT'5)，2端各4个碱基硫代磷酸化修饰；溴化已锭(EB)和TB溶液：由上海生工生物技术有限公司提供；紫外透射分析仪和紫外分光光度仪：均购自上海精密仪器有限公司。

　　1.2  缝线的准备和分组  分为实验组(A组，10-0尼龙线组)、实验对照组(B组)、空白对照组(C组)。A、B组又分为三小组，A1组：将10-0尼龙线2.0 cm浸于浓度为330 g/L的TGF?β2反义寡核苷酸溶液中24 h；A2组：A1组缝线晾干后再浸泡24 h，共48 h；A3组：A2组缝线晾干后再浸泡24 h，共72 h。B1、B2、B3组与A1、A2、A3组相同，只是TB溶液代替TGF?β2反义寡核苷酸溶液。C组的缝线不用特殊处理。

　　1.3  制备的缝线紫外线灯下检测  A组、B组、C组的10-0尼龙线浸于EB溶液中1 s后，置于紫外线灯下观察。

　　1.4  制备的缝线紫外分光光度仪检测  A组3根缝线经过以上处理后，置于0.5 ml生理盐水中水浴震荡后，分别于1 h、2 h、3 h取其溶液在紫外分光光度仪220 nm和280 nm处检测A值。

　　2  结果
　　
　　A组、B组、C组的10-0尼龙线在紫外线灯下均不发光，说明缝线不能携载TGF?β2反义寡核苷酸；将浸于TGF?β2反义寡核苷酸溶液中的10-0尼龙线水浴后在紫外分光光度仪下检测，其A值与对照组差异无显著性，进一步证明缝线不能携载TGF?β2反义寡核苷酸。

　　3  讨论
　　
　　反义寡核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体的寡核苷酸片断，长度为15个～30个核苷酸，其通过碱基互补原理干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工乃至输出和翻译各个环节，从而调节细胞的生长和分化等。目前，反义寡核苷酸在防治眼科瘢痕方面已显示出良好的应用前景，特别在青光眼和角膜病方面，以往的研究表明，TGF?β2是机体修复的启动因子［4］，我们设想若手术缝线可以携载TGF?β2反义寡核苷酸，在手术中可直接将反义寡核苷酸带入手术创面，避免了局部点药的泪液冲刷和繁琐，也避免了全身用药的副作用，为反义寡核苷酸导入靶组织提供一个新的途径。曲乐丰等［3］研究发现8?0薇乔缝线可携载c?myc反义基因，推测可能是保护薇乔缝线表面涂有50%的硬脂酸钙，Ca2+带正电荷，与反义寡核苷酸的磷酸根离子或化学修饰集团的负电荷结合，类似基因转染中的磷酸钙沉淀法。EB是一种荧光染料，它可以嵌入核酸链的碱基之间，将携载核酸的缝线置于紫外线下，嵌入核酸链的碱基之间的EB在紫外线激发下可以产生红色荧光，似烧红的铁丝样。我们反复实验浸有TGF?β2反义寡核苷酸的10-0尼龙线，在紫外线灯下均未见红色荧光，说明缝线不能携载TGF?β2反义寡核苷酸，具体原因尚不明了，推测可能因为10-0尼龙线细，单股致密，表面光滑，未经任何修饰等原因，根本不能携载或所携载的反义寡核苷酸量非常少，我们用紫外透射分析仪和紫外分光光度仪不能监测到罢了。总之，本实验没有监测到10-0尼龙线携载TGF?β2反义寡核苷酸，目前只能通过其他途径如局部注射、载体等将TGF?β2反义寡核苷酸带入靶组织，达到减轻瘢痕的目的。

【】
  　　［1］ Palmer SS. Mitomycin as adjunct chemotherapy with trabeculectomy［J］. Ophthalmology， 1995，98:317?321.

　　［2］ Bennett MR， Schwartz SM. Anti?sense therapy for angioplasty restenosis［Ｊ］．Some critical consideration，1995， 92:1981?1993.

　　［3］ 曲乐丰，景在平，曹贵松. 手术缝线携载c?myc反义基因的研究［J］. 中华实验外科杂志，2000，17：207?208.

　　［4］ Kay EP， Lee　HK， Park KS， et al. Inderect mitogenic effect of transforming growth factor?beta on cell proliferation of subconjunctival fibroblasts［J］. Invest OphthalmolVisSci，1998， 39:481?486.