拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的临床观察及YMDD耐药变异株检测

                    作者：涂海健，林国贤，郭金者，许光辉，刘信禹，周燕锋

【关键词】  拉米夫定

   ［摘  要］ 目的：探讨拉米夫定在慢性乙型肝炎患者的疗效以及监测拉米夫定临床治疗过程中耐药性的产生，更好地指导临床用药。方法：对117例用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者，进行HBVDNA含量、ALT、HBeAg检测以观察其疗效，同时对出现治疗后HBVDNA反弹和ALT回升的患者，进行乙型肝炎病毒聚合酶基因(Pgene)酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸YMDD位点变异性测定。结果：拉米夫定治疗2个月、6个月、12个月、18个月后HBVDNA阴转率分别为86．2％、90．6％、84．6％、82．1％，HBVDNA含量下降明显。ALT复常率为10．3％、68．4％、82．9％、81．2％。HBeAg的阴转率相对较低为0．85％、3．4％、16．2％、36．8％。117慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗6个月后YMDD变异2例，12个月16例，到18个月累计共有19例YMDD变异阳性的患者，占16．2％，其中以YVDD变异为主，YVDD变异14例，占73．7％，而YIDD变异仅5例，为26．3％。发生YMDD变异的患者HBVDNA含量以及ALT回弹，HBeAg发生阳转。结论：拉米夫定是一种乙型肝炎抗病毒治疗新药，具有很强的抑制HBV复制的作用，对慢性乙型肝炎有较好的临床疗效。但随拉米夫定长期服用可能出现耐药性，主要是由HBVP基因区YMDD的变异所引起的，产生YIDD、YVDD耐药突变株，对YMDD耐药变异株的监测，为抗病毒治疗提供分子生物学依据以及指导临床用药。

    ［关键词］ 拉米夫定；慢性乙型肝炎；YMDD变异

    拉米夫定是一种新抗HBV药物，为核苷类似物、逆转录酶抑制剂，具有很强抑制HBV复制的作用，对慢性乙型肝炎治疗具有较好的临床疗效，但长期服用拉米夫定，部分患者可产生拉米夫定耐药，研究表明，拉米夫定耐药是HBV病毒逆转录酶编码区发生变异，特别是HBV聚合酶基因P基因活性区发生YMDD变异为最常见和重要［1～4］。笔者观察117例慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗效果，YMDD变异情况以及他们的临床表现，现报道如下。

    1  资料与方法

    1．1  病例选择  117例病人均为我院门诊或住院慢性乙型肝炎患者，其中男91例，女26例，年龄12岁~67岁，诊断均符合2000年全国传染病与寄生虫病分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案的诊断标准，服用拉米夫定前，117例慢性乙型肝炎患者ALT>80 μl/L(正常高值的两倍)，HBVDNA>106 copy/ml，拉米夫定治疗剂量为100 mg/d，排除其他原因引起的肝功能损害。定期随访，发现治疗过程中有HBVDNA含量或ALT同弹者收集其血清标本，-20 ℃保存，以备YNDD耐药突变株测定。

    1．2  血清标志物与肝功能测定  血清标志物由意大利Alisei全自动酶免分析仪测定，试剂为厦门新创公司提供，肝功能用贝克曼CX9生化仪分析，试剂贝克曼公司提供。

    1．3  HBV-DNA定量  Roche公司生产Light cycler实时荧光定量扩增仪测定，深圳市匹基生物股份有限公司提供试剂，检测范围为4．2E+02~4．2E+08。

    1．4  YMDD耐药变异株测定  Roche公司Light cycler实时荧光PCR扩增仪测定。熔点曲线法(寡核苷探针与模板结合时，不匹配碱基显著影响熔解温度的原理，采用PCR体外扩增方法结合杂交探针荧光检测技术)，用Light cycler软件对结果进行分析，试剂为深圳市匹基生物股份有限公司提供。

    1．4．1  质控标准  阴性对照的Ct值应无数值，无Tm值：Ct野生型YMDD对照(30．0，Tm值值为50．0 ℃；Ct突变型YIDD对照(30．0，Tm值参考值为42．5 ℃；Ct突变型YVDD对照(30．0，Tm值参考值为55．5 ℃；上面任何不符，则应重新进行PCR检测。

    1．4．2  野生型与突变型分析  要求：A：Tm=Tm(YMDD对照品)±1.5 ℃，判为野生型YMDD；B：Tm=Tm(YVDD对照品)±1．5 ℃，判为突变型YVDD；C：Tm=Tm(YIDD对照品)±1．5 ℃，判为突变型YIDD。

    2  结果

    2．1  拉米夫定治疗后临床主要指标HBVDNA，ALT，HBeAg检测结果  观察拉米夫定(100 mg/d)治疗2个月、6个月、12个月、18个月后患者人体外周血HBVDNA含量和肝功能主要指标ALT及HBeAg情况，发现服用拉米夫定后，患者外用血中的HBVDNA含量(对数表示)迅速下降或转阴，ALT(1 U/L)伴随HBVDNA含量迅速降低也逐渐下降，HBeAg出现阴转结果，见表1。

    表1  拉米夫定治疗2个月~18个月后临床主要指标HBV（略）

    2．2  YMDD耐药变异株检测结果  117例慢性乙型肝炎患者进行拉米夫定治疗后(100 mg/d)随访HBVDNA含量或ALT回弹者，进行YMDD变异测定，结果治疗6个月后有2例发生YMDDYVDD变异，12个月YMDD变异增加到16例，18个月为19例，占16．2％(19/117)，其中以YVDD变异为主14例，占73．7％(14/19)，YIDD变异为5例，占26．3％(5/19)。117例慢性乙型肝炎患者有2例经拉米夫定治疗后，HBVDNA含量有所下降后，然后一直在105 copy/ml~106 copy/ml之间变化，经YMDD变异检测，无发现YMDD变异。

    2.3  YMDD变异者HBVDNA含量，ALT，HBeAg的改变  19例YMDD变异的慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗前HBVDNA含量较高为1．017×107 copy/ml～3．621×10８ copy/ml之间，治疗2个月后明显下降，其中有1例下降为104 copy/ml，2例为103 copy/ml，16例下降到检测范围下限以下，但6个月后有2例YMDDYVDD变异，测HBVDNA一个106 copy/ml，另―个105 copy/ml，而到12个月后YMDD变异增加为16例HBVDNA含量为(6．044±0．583)copy/ml，18个月增加到19例HBVDNA含量为(5．825±0．776 5)copy/ml，1例高于治疗前水平，占YMDD总变异中的5．26％，其他的HBVDNA含量都小于治疗前水平，YMDD变异患者拉米夫定治疗前ALT平均为(202．47±82.11)IU/L，治疗6个月后ALT有所下降为(48．95±28．83)IU/L，治疗12个月、18个月后ALT反弹分别为(92．95±40．62)IU/L，(98．73±34．04)IU/L，19例YMDD变异者的ALT水平都较拉米夫定治疗前为低，其中2例继续服用拉米夫定，出现ALT水平反复，低于正常值一段时间后，又有低值的升高，19例患者都没有出现黄疸或其他的严重症状。治疗前HBeAg都为阳性，治疗过程中随访分别在6个月、12个月、18个月后进行二对半检测，只有4例在12个月时HBeAg变为阴性，但18个月测又全为阳性。

    3  讨论

    拉米夫定是新一代核苷类似物，具有强有力的抑制HBV逆转录酶的作用，其抑制HBV复制作用机制是药物在细胞内磷酸化后与脱氧胞嘧啶核苷竞争，进入合成中的cDNA链，使其不能继续延伸而终止复制，从而阻断HBV复制中的逆转录(RNA至DNA)过程［5］，是当前认为慢性乙型肝炎，安全有效的药物。从本实验可以看出，117例慢性乙型肝炎患者，用拉米夫定治疗2个月后外周HBVDNA阴转率就达86．3％，治疗6个月阴转率最高为90．6％，治疗12个月、18个月也都达80％以上，没有阴转患者的HBVDNA的含量也大幅下降，跟治疗前相比差异有显著性(P<0．01)。ALT伴随HBVDNA含量迅速降低也逐渐下降，治疗2个月后，复常率为10．3％，6个月达68．4％，12个月、18个月复常率分别为84．6％、81．2％，但因个别HBVDNA反弹，ALT也渐渐回升，而使ALT非复常患者12个月、18个月的ALT值有所上升。HBeAg阴转较慢，6个月之前阴转率<5％，12个月仅为16．2％，治疗18个月后达36．8％，所以拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎疗效显著，特别是阻断HBVDNA的复制，起效快，阴转率高，能有效改善肝功能，ALT复常率较高，但对HBeAg的阴转率相对较低。检测YMDD变异的方法很多种，主要是用基因测序的方法来测定，本试验是依据寡核苷探针与模板结合时，不匹配碱基显著影响熔解温度的原理，采用PCR体外扩增方法结合杂交探针荧光检测技术一熔点曲线法，该方法同测序方法同样灵敏，但使用更快速、简便［6，7］，易在临床得到推广应用，本试验用该方法监测117例口服拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者YMDD变异，治疗6个月就检出2例，并随治疗时间的延长变异逐渐增多12个月16例，到18个月累计共有19例YMDD变异阳性的患者，分别占13．7％、16．2％，与姚光弼等［8］报道拉米夫定治疗1 a为14．6％、Lai［9］等报道为16％~32％基本相符。其中以YVDD变异为主，YVDD变异14例，占73．7％，而YIDD变异仅5例，为26．3％。YMDD变异后HBVDNA都不同程度反弹，但除1例外其他都低拉米夫定治疗之前，认为YMDD变异后对拉米夫定的敏感性下降，但变异株还不是主要的优势株以及原来病毒自身的复制能力降低，HBVDNA含量比治疗之前低，所以YMDD变异后继续用药仍可有效。117例慢性乙型肝炎患者有2例经拉米夫定治疗4周~6周，HBVDNA含量下降到105 copy/ml，以后测定都在105 copy/ml～106 copy/ml之间变化，经YMDD变异测定未检测到YMDD的变异，可能是YMDD以外的其他位点产生变异有关。对于19例YMDD变异的其他临床指标观察，随着YMDD变异的出现HBVDNA含量升高，ALT也不同程度的升高，但都较拉米夫定治疗前为低，其中2例YMDD变异后继续用药，山现ALT水平反复，有时为正常，有时出现低值升高。19例YMDD变异者HBeAg，4例12个月时阴转，但18个月YMDD变异后又转成阳性。综上所述，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎具有显著效果，但长期用药可出现耐药，而使治疗不敏感或失效。为了避免HBV耐药的发生，目前也提出一些观点，最主要的共识认为拉米夫定与其他核苷类似物或干扰素联合应用能够提高疗效和减缓变异［10］，同时建议长期服用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者，要密切动态观察HBVDNA含量和ALT的变化，监测YMDD变异情况，为临床用药提供重要的依据。

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    ［9］  Lai C，Chien R，Leung NWY，et al．A oneyear trial of chrcnic hepatitis. B［Ｊ］. N Engl J Med，1998，339(2)：6167.

    ［10］  舒欣，李刚.姚集鲁.拉米夫定治疗乙型肝炎耐药性的产生及YMDD变异的研究［J］．国外医学内分册，2000，27(7)：302308.