匹那地尔对大鼠心肌细胞内钙及舒缩功能的影响
作者：林茹, 张泽伟, 曹春梅, 舒强, 夏强/
【摘要】 目的探讨匹那地尔对高钾停搏液处理后大鼠离体心肌细胞内游离钙与舒缩功能的影响。方法SD大鼠心室肌细胞酶解分离静息1～2 h后随机分为对照组，高钾停搏液组，匹那地尔强化组，格列苯脲拮抗组。四组细胞均在24℃下保存2 h,此后对细胞进行复氧、复灌20 min并测定细胞收缩、［Ca2+］i瞬态、肌浆网内贮钙释放功能。结果匹那地尔使心肌细胞在缺血再灌注中收缩功能，［Ca2+］i瞬态，肌浆网内贮钙释放能力明显优于高钾停搏液组（P＜0.01〉及细胞内钙释放后的钙峰回落时间明显短于高钾停搏液组（P＜0.01〉。结论匹那地尔通过维持良好的肌浆网和细胞膜Na+/Ca2+交换体功能来调节钙瞬态变化，减少细胞内钙超载从而改善心肌细胞缺血后收缩功能，同时避免了高钾停搏液的负面效应。
【关键词】 心脏停搏液；心肌细胞；大鼠
Pinacidil Improves Contractile Function and Intracellular Ca2+ in Isolated Rat Cardiac Myocytes
Abstract: OBJECTIVEWe examined the effects of pinacidil on contractile function and intracellular calcium in isolated rat cardiomyocytes exposed to cardioplegic solution.METHODSRat myocytes were incubated at 24℃for 2 hours in cardioplegic solution with or without pinacidil (50mmol/L), then they were perfused with Krebs-Henseleit solution with a gas phase of 95% O2 / 5% CO2 at the same temperature. Parameters of contraction and intracellular calcium ［Ca2+］i transients were then measured by video tracking and spectrofluorometry. RESULTSDuring 20 minutes of perfusion after 2 hours in cardioplegic solution with pinacidil: (1) the recovery of contractile functions was significantly increased in terms of both amplitude of contraction (98.30%±9.90% vs 81.00%±11.25%, P<0.05) and peak velocity of cell shortening (100.90%±13.79% vs 76.89%±18.14%, P<0.01) when compared with myocytes in cardioplegic solution without pinacidil; (2) the amplitudes of the ［Ca2+］i transients evoked by electrical stimulation and caffeine (10mmol/L) increased by 23.31%～40.72% and 61.73%, respectively, over those in cardioplegic solution without pinacidil; and (3) the decay time of the caffeine-induced［Ca2+］i transient decreased by （36.64 ± 15.10）% relative to that measured in cardioplegic solution without pinadicil. The effects induced by supplementing the cardioplegic solution with pinacidil were diminished in the presence of glibenclamide (10mmol/L).CONCLUSIONAddition of the ATP-sensitive potassium channel opener pinacidil to a high potassium cardioplegic solution improves recovery of contractile function and cytosolic Ca2+ in isolated rat cardiac myocytes.
Key words：Cardioplegic sloution; Myocyte;Rat
虽然高钾停搏液能起到较好的心肌保护作用，但仍有证据表明暴露在这种溶液后的心肌功能有一定程度的损害，如心肌收缩力下降，细胞内钙超载［1］，可能与肌浆网钙释放及Na+/Ca2+交换体的钙外排减少有关［2］。激活ATP敏感钾通道（KATP）可减少L-型钙通道的钙内流，促进Na+/Ca2+交换体的钙外排，使细胞免于损伤和顿抑［3，4］。本研究目的在于用单细胞收缩、细胞内钙［Ca2+］i瞬态、内质网钙释放等功能检测来探讨KATP非特异性开放剂（匹那地尔）对高钾停搏液处理后大鼠离体心肌细胞内游离钙与舒缩功能的影响。
1材料与方法
1.1药物与试剂匹那地尔（Pinacidil 批号60K1387），格列苯脲(Glibenclamide 批号58H0570)，Fura-2/Am(批号108964-32-5), 均购自美国Sigma公司。
无钙Tyrode氏液配制（mmol/L）：NaCl 100、KCl 10、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O 5、 葡萄糖 20、 牛磺酸 20，3-(N-吗啉代)丙磺酸10。冲100% O2用KOH(5mol/L)调至pH 7.20。K-H液（mmol/L）：NaCl 118.5、NaHCO325、KCl 4.75、MgSO41.2, KH2PO41.2、CaCl22.5、葡萄糖11.1。
1.2左心室单细胞制备成年SD大鼠20只，由浙江大学医学院动物实验室提供。雌雄不拘，体重232 g～252 g，断头处死后，迅速开胸取出心脏，置于4℃氧饱和Tyrode氏液中洗净血液后固定于Langendorff灌流装置上用95％O2＋5％CO2饱和的K-H液恒温（37℃）恒流行主动脉逆行灌注，流速10 ml/min。酶解法分离心室肌细胞［5］。先以无钙Tyrode氏液灌流5 min，再以含I型胶原酶0.3 g/L的低钙（50μmol/L）Tyrode氏液灌流5min。取下心脏，去掉心房和基底部组织，将左心室肌剪碎，用吸管缓慢吹打，于含1%牛血清白蛋白的低钙Tyrode氏液中37℃孵育15 min, 再将细胞悬液用直径200 mm单层尼龙网过滤，滤液在无钙Tyrode氏液中分三步复钙至Ca2+浓度为1.25×10-6 mol/L［第一次复钙：20ml细胞混悬液+20ml无钙液+70μl （72mmol/L）钙母液, 10 min～15 min后吸取上端20 ml悬液, 第二次复钙:20 ml细胞混悬液+20 ml无钙液+14μl （720mmol/L）钙母液, 10 min～15 min后吸取上端20 ml悬液, 第三次复钙: 20 ml细胞混悬液+20 ml无钙液+28μl （720 mmol/L）钙母液，10 min～15 min后吸取上端20 ml悬液，其余部分过滤，10 min～15min后吸取上端20 ml悬液］。心肌细胞在室温下静置1 h～2 h后且镜检成活率大于80%。
1.3随机分组方法对照组（Con组，）：置于无氧乳酸林格氏液; 高钾停搏液组(CP组)：置于含20 mmol/L KCl的无氧乳酸林格氏液; 匹那地尔组(CP+P组)：置于含20 mmol/L KCl和50 mmol/L匹那地尔的无氧乳酸林格氏液; 格列苯脲拮抗组(CP+P+G组)：置于含20 mmol/L KCl、50 mmol/L匹那地尔及10 mmol/L格列苯脲的无氧乳酸林格氏液。以上各组细胞均在24℃下保存2 h，然后用95％O2＋5％CO2饱和的K-H液复灌，镜下选择横纹清晰，胞膜光整的杆状活细胞来进行实验。匹那地尔和格列苯脲的用量见［6］。
1.4检测指标
1.4.1单细胞舒缩测定100μl细胞悬液滴于自制灌流槽中并用95％O2＋5％CO2饱和的K-H液持续灌流（2ml/min）。以0.2 Hz频率，50V强度的电场刺激心肌细胞，视频跟踪机系统( MedEase-1，南京美易科技有限公司)检测舒缩参数［收缩幅度(dL)，最大收缩速度(+dL/dtmax)，最大舒张速度(-dL/dtmax)和舒张末期长度］。存储动态图像用MedEase软件分析［5］。心肌细胞在复氧、复灌3 min时的各舒缩参数为基础值，之后连续灌注20min,每隔5 min测定一次舒缩参数。
1.4.2细胞内钙瞬态测定用细胞内双波长钙荧光系统（T.I.L.L，Photonics GmbH, Grfelfing德国）检测细胞内游离钙浓度， Fura-2/AM为钙指示剂。先用10-6mol/L Fura-2/AM在室温下负载30 min，在频率为0.2Hz，强度为50V的电场刺激下产生的细胞内钙离子浓度峰值为钙瞬态。光信号通过T.I.L.L放大器经Digidata1200输入计算机， pClamp7.0软件分析。荧光激发波长分别为340 nm和380 nm，发射波长510 nm，其荧光比值可反映细胞内钙离子浓度［5］。心肌细胞在复氧、复灌3 min时的钙瞬态为基础值，之后连续灌注20 min,每隔5 min测定一次钙瞬态。
1.4.3肌浆网内贮钙释放功能测定［7］复灌的心肌细胞在电刺激下稳定5min，停止刺激15s加入咖啡因（10mmol/L ）［8］。咖啡因诱导的钙峰与电刺激诱导的钙峰的比值来表示肌浆网内贮钙释放的能力;并测算两种钙峰起落点时间比值来间接反映细胞膜Na+/Ca2+交换体的功能。
1.5统计学处理
计量资料以均数±标准差( ±s )表示，用SPSS10.0软件进行分析，组间比较用单因素方差分析，组内比较用配对t检验，咖啡因实验数据用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1心肌细胞收缩功能的变化在复氧、复灌过程中随着灌流时间的延长CP+P组的细胞舒缩参数恢复率明显优于其他三组（P<0.05）。 与Con组比较，高钾停搏液处理后的三组心肌细胞的舒张末长度恢复率明显增高（P<0.05）；与CP组比较，CP+P组的收缩幅度和最大收缩速度明显增高（P<0.05）；与CP+P组比较，CP+P+G组的收缩幅度和最大收缩速度明显降低（P<0.05）（见表1）。表1 心肌细胞复氧、复灌收缩功能恢复率 (略)注： * P<0.05,** P<0.01 与 基础值 (0)比较；#P<0.05, ##P<0.01 与 control比较；ΔP<0.05, ΔΔP<0.01 与 CP比较;
2.2心肌细胞钙瞬态的变化与Con组比较，高钾停搏液处理后的三组心肌细胞钙瞬态下降幅度明显减小（P<0.05），与CP组比较，CP+P组的心肌细胞的钙瞬态下降幅度明显减小（P<0.01），与CP+P组比较，CP+P+G组的心肌细胞的钙瞬态下降幅度明显增大（P<0.01）（见图1）
2.3咖啡因诱导的肌浆网钙释放的变化CP+P组的心肌细胞肌浆网内贮钙释放幅度明显高于CP组（P<0.01），与CP+P组比较，CP+P+G组内贮钙释放幅度明显降低（P<0.05）（见图2）。
2.4细胞膜Na+/Ca2+交换体的变化与Con组比较，CP组和CP+P组的肌浆网内贮钙释放后钙峰回落时间明显缩短（P<0.05），与CP组比较,CP+P组的回落时间明显缩短（P<0.01），与CP+P组比较，CP+P+G组的回落时间明显延长（P<0.01）,（见图3）。
3讨论
心室肌细胞酶解分离，是目前较成熟单细胞分离方法。它操作简单，可靠，获得的细胞成活率高，较适合行单细胞功能研究。心肌收缩功能和钙瞬态的检测也为目前较先进的细胞内钙测定方法，设备性能稳定，可靠且灵敏度高。
虽然高钾停搏液能起到较好的心肌保护作用，但还是有证据表明暴露在这种溶液后的心肌功能仍有一定程度的损害，如心肌收缩力下降，细胞内钙超载［1］。钙超载的机制可能与电压依赖钙通道开放诱导肌浆网钙释放及Na+/Ca2+交换体的钙外排减少有关［2］。细胞内钙超载可抑制Ryanodine受体使得咖啡因诱导的肌浆网钙释放能力下降［9］。也有报道高钾停搏液还可引起心肌细胞内氢离子浓度的增高，后者减少肌浆网钙释放并抑制细胞内钙与心肌纤维Troponin C结合，从而导致收缩力下降［10，11］。目前的研究显示经匹那地尔强化的高钾停搏液处理后的心肌细胞在再灌注过程中具有更好的收缩功能，肌浆网更多的内贮钙释放，细胞内钙外排加快，后者对减轻细胞内钙超载具有重要意义，也说明高钾停搏液所致的细胞收缩力下降可能与肌浆网及Na+/Ca2+交换体的钙调控作用减退有关。
用ATP敏感性钾通道开放剂人为诱导超极化状态的心肌细胞可缩短心肌动作电位、减少钙离子内流及能量消耗，减少再灌注时钙超载引起的损伤 ［12，13］。虽然激活肌膜和线粒体KATP均可起到心肌保护作用，但线粒体KATP更重要。也有报道激活肌膜KATP可减少L-型钙通道的钙内流，并加强Na+/Ca2+交换体的钙外排，减少细胞收缩能耗，使细胞免于损伤和顿抑［3，4］，本实验结果与其一致。
由膜的电兴奋转化为肌纤维机械收缩过程之间，中介为兴奋-收缩耦联。主要有三个步骤：电兴奋通过横管系统传向肌细胞的深处；三联管结构处的信息传递；肌浆网中的Ca2+释放入胞浆以及Ca2+由胞浆向肌浆网的再聚积。本实验仅从细胞内Ca2+动态变化这一切入点来研究细胞收缩功能。用单细胞模型来研究细胞收缩和钙之间的关系，其优越性在于细胞收缩功能的变化可不受神经体液、前后负荷及冠脉血流等因素的影响，局限性在于人为理想的细胞内外基质离子弥散状态，在人体内并不存在，另细胞连续暴露在高钾停搏液中也与临床实际应用情况如主动脉阻断给高钾停搏液有所不同。高钾停搏液所致心室功能下降的病理生理机制是复杂的仍不清楚，但与高钾引起的钙超载有关 ［14］。要认清离子平衡与收缩的关系还需寻找更精密并接近临床的实验方法。本实验所选用钾浓度参照临床常用剂量，匹那地尔和格列苯脲拮抗剂的选择和剂量参照本实验室过去的研究和相关文献［6］。
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