脊髓缺血损伤动物模型的建立

                         作者：管玉龙，刘锋，董培青，万彩红，杨璟

【摘要】  目的本研究拟建立胸降主动脉手术脊髓缺血动物模型，为脊髓保护策略和药物干预研究提供基础。方法实验中采用6只北京农大小型猪。经左侧第五肋间开胸，常温条件下在锁骨下动脉以远阻断降主动脉，30min后阻断开放。动物复苏后，对其下肢行为学临床评分每日进行观察。7日后处死动物取材，进行损伤区域脊髓超微结构观察。结果术中血液动力学平稳。血气结果均维持在正常范围。复苏后1只动物术后每天肌力均为IV 级，7天后处死时肌力IV～V级；其余5只动物术后下肢肌力0 ～I级。显微镜超微结构观察显示脊髓较严重的损伤性改变。结论应用小型猪为动物模型，在常温条件下胸降主动脉阻断30min，可以建立急性脊髓缺血术后截瘫模型。

【关键词】  脊髓；缺血；胸主动脉

　　The Establishment of Porcine Model of Spinal Cord Ischemic Injury

　　Abstract: OBJECTIVE This study was designed to establish a porcine model of spinal cord ischemic injury produced by descending thoracic aorta occlusion and provide basis for strategy of spinal protection and pharmaceutical intervention. METHODSSix piglets were used in the experiments supplied by the Beijing College of Agriculture. A standard left thoracotomy was made through the fifth intercostal's space. The descending aorta was clamped distal to left subclavian artery at normothermia. Thirty minutes later, the clamps were released. The trachea was extubated once the animals recovered breathing spontaneously. The animals were evaluated daily according to a quantitative behavioral score. On postoperative seventh day the animals were sacrificed and histological analysis for the injury of spinal cord was made. RESULTSHemodynamic data showed all animals were stable before, during and after the procedure. The results of behavioral scoring for each animal demonstrated one animal with paraparesis and other 5 animals with paraplegia. The injury of spinal cord was also demonstrated by ultrastructural measurement.CONCLUSIONA porcine model of spinal cord ischemic injury can be established by descending thoracic aortic clamping thirty minutes at normothermia.

　　Key words：Spinal cord；Ischemia；Thoracic aorta

　　胸主动脉疾病实施外科期间，围术期多种因素可能引起脊髓缺血，术后脊髓并发症一旦发生，直接影响手术效果和患者的生存质量。根据报告，多以单纯阻断降主动脉30min为临床界定的安全时限。本研究对实验动物进行胸降主动脉阻断30min后随访观察，建立了脊髓缺血动物模型，可为进一步的脊髓保护策略和药物干预提供基础。

　　1材料与方法 

　　1.1实验动物

　　6只北京农大小型猪，体重20 kg～25.9 kg，雌性，在实验前12 h禁食，4 h禁水。

　　1.2麻醉基础

　　麻醉采用肌注盐酸氯胺酮（15 mg/kg）、阿托品（0.03 mg/kg）。应用20G静脉穿刺针实施耳静脉穿刺。麻醉诱导采用盐酸氯胺酮（4 mg/kg）、阿端（0.3 mg/kg）、芬太尼（0.01 mg/kg）静脉注射。气管插管（内径7.5或8.0），呼吸机通气呼吸，潮气量15～20 ml/kg，频率20～25次/min。术中麻醉维持采用盐酸氯胺酮（2 mg/kg）、阿端（0.2 mg/kg）、芬太尼（0.004 mg/kg）静脉注射，每20 min一次。

　　1.3手术方法

　　动物右侧卧位，经肩胛骨下方第五肋间隙横行皮肤切口，切口长度约15cm。逐层切开皮下组织，暴露胸腔。探查降主动脉的部位，并仔细分离锁骨下动脉以远0.5cm～1cm区域降主动脉外膜，4.0手术线缝置荷包，分离其下方远心端0.5cm区域降主动脉，套阻断带作为第一阻断平面。在降主动脉第一阻断平面部位以远4cm～5cm 处进行第二处分离，同样套阻断带和缝置荷包，作为第二阻断平面。在第一荷包和第二荷包分别插套管针，连接三通，进行压力测定和取血。待第一、第二阻断平面阻断带放置完成后，体内给肝素150IU/kg。首先在第一阻断平面使用阻断钳阻断降主动脉血流，阻断期间密切观察血压变化，必要时给予一定的扩血管药物。继续使用第二把阻断钳阻断第二平面降主动脉血流（见图1）。阻断30min后开放阻断钳，顺序是先开放远心端阻断钳，后开放近心端阻断钳。鱼精蛋白中和体内肝素（比例1∶1）。

　　1.4监测指标

　　1.4.1术中持续血压检测，在阻断前、阻断后、开放后检测血气和电解质，根据结果给予一定量的碳酸氢钠、氯化钾。

　　1.4.2术后每日观察动物脊髓损伤程度，按照胥少汀法进行下肢行为学临床评分。胥少汀法分级如下：0级：后肢和尾部无活动（不包括后肢痉挛）I级：后肢和尾部轻微活动II级：后肢和尾部有活动，可带动关节，甚至I 肢可站立III级：双后肢可站立，但不能走动，尾部摇摆IV级：双后肢可站立、行走，跑则不稳，尾部摇摆或翘起V级：正常走、跑

　　1.4.3术后7天处死动物，取脊髓标本，采用电子显微镜进行脊髓组织细胞超微结构的观察。

　　2结果

　　2.1血液动力学术中血液动力学平稳，阻断前血压维持在100～120 mm Hg，心率120～140次/min。在阻断后近心端血压明显上升，心率先加快后减慢，给予药物降压处理维持在90～100次/min。远心端血压20 mm Hg。开放后血压较术前有一定的下降，但没有统计学意义。

　　2.2血细胞手术期间动物血细胞压积和血色素轻度下降，7天后处死时基本恢复正常。

　　2.3温度手术期间肛温变化不明显，术前为36.5℃～37℃，阻断期间肛温35.5℃～36℃，手术结束时肛温36℃～36.5℃。

　　2.4下肢行为学动物术前上下肢肌力均为V级，阻断30 min术后动物顺利清醒拔除气管插管，上肢肌力恢复正常V级，其中1只动物术后3 h下肢肌力I级，6 h下肢肌力IV级，术后每天肌力均为IV 级，7天后处死时肌力IV～V级；其余5只动物术后下肢肌力0～I级。

　　2.5组织细胞超微结构电子显微镜超微结构观察显示，阻断30min后脊髓神经胶质细胞正常，髓鞘板层结构松解，轴索收缩，见图2。

　　3讨论

　　胸主动脉疾病是心血管疾病领域中发病率较高、而且风险较大的疾病。在婴幼儿，主要表现为主动脉弓缩窄或主动脉弓离断，主动脉弓缩窄约占先天性心脏病的5%～8%，主动脉弓离断约占先天性心脏病的1%～4%。在成人，则以胸主动脉瘤多见，发病率约为4/10万～6/100万人，并且在高龄人群中发病率更为上升［1］。目前，胸主动脉瘤中部分需要外科纠治，尤其是病变累及范围较广的病例。手术过程中的外科操作可能影响脊髓的血液供应，当动脉瘤累及范围广，手术时可能造成肋间动脉损伤。常温非转流实施主动脉弓降部缩窄矫治术或者主动脉弓部瘤手术，也可能导致脊髓缺血。术后脊髓并发症的发生率为5%～10%［2,3］，我们的临床实践中也有发生［4］。

　　Wan等研究认为，影响主动脉疾病手术后发生脊髓损伤的危险因素包括：（1）脊髓缺血的时间及程度；（2） 主动脉修复后脊髓血运的重建状况；（3）生化因素介导的脊髓再灌注损伤［5］。Cooley 等认为缺血时间是影响脊髓损伤的最重要的因素，主动脉阻断的安全时限为30 min。阻断时间低于15 min， 截瘫发生率为0，阻断时间超过60 min时其发生率为25%～100%［6］。Svensson 等认为未能成功进行重要节段动脉移植会引起脊髓缺血［7］。

　　由于脊髓缺血是引起脊髓损伤的主要原因，因而术中及术后维持脊髓充足的血液供应对于预防术后神经系统的损伤极其重要。但在以往的报告中，临床研究为多见。由于临床患者病情复杂，个体差异性大，因此一些结果说服力不强。建立急性脊髓缺血模型，并在此基础上开展进一步的研究和探索是首要问题。文献中有多种模型和方法可以实现脊髓缺血。Zhang、Toung等使用大鼠作为实验动物，Contreras等在实验中使用了犬建立脊髓缺血模型。Strauch、Toumpoulis等则选择猪作为实验对象［8-12］。随着基础研究的进一步深入，近几年文献中一些学者主张采用猪作为实验模型，研究发现猪的解剖学特点与人体有很大的相似性，因而越来越多的文献研究以猪作为实验模型。本课题组在前期的脑保护实验中，采用小型猪作为实验模型，取得了较好的实验结果［13］。

　　为在胸降主动脉脊髓保护进行深入研究，在前期临床研究的基础上，设计慢性动物实验模型，使用小型猪作为实验对象。实验中模拟临床胸降主动脉手术方案，动物采取右侧卧位，经肩胛骨下方第五肋间隙暴露胸腔。与临床手术基本一致。仔细分离锁骨下动脉以远降主动脉，并阻断降主动脉血流30 min，术后观察动物下肢行为学评分，从而对脊髓损伤程度进行准确评估。结果发现胸降主动脉单纯阻断30 min后，实验动物均出现严重的脊髓损伤。其中1只动物术后每天肌力均为IV 级，7天后处死时肌力IV～V级，表现为下肢轻瘫；其余5只动物术后下肢肌力0 ～I级，表现为双下肢截瘫。细胞超微结构检查证实胸降主动脉单纯阻断30 min发生严重的脊髓缺血损伤性表现。因此提示手术中单纯阻断降主动脉30 min时有可能发生严重的脊髓损伤性表现。

　　本组实验方案模拟主动脉弓降部手术单纯阻断技术，获得了急性脊髓缺血模型，并进行了慢性观察，因而为今后该领域的进一步深入研究提供了基础。

【文献】
  　　［1］董培青. 胸主动脉夹层动脉瘤的诊断与治疗现状［J］. 体外循环杂志, 2003, 1:193-197.

　　［2］Rahman A, Ustundag B, Burma O,et al. Neuroprotective effect of regional carnitine on spinal cord ischemia--reperfusion injury［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2001, 20: 65-70.

　　［3］Coselli JS, LeMaire SA. Left heart bypass reduces paraplegia rates after thoracoabdominal aortic aneurysm repair［J］. Ann Thorac Surg,1999,67:1931-1934.

　　［4］董培青, 何美玲, 管玉龙, 等. 414例胸主动脉瘤手术的体外循环经验［J］. 中华胸心血管外科杂志, 2002, 18:131-133.

　　［5］Wan IY, Angelini GD, Bryan AJ,et al. Prevention of spinal cord ischaemia during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2001, 19:203-213.

　　［6］Cooley DA. Single-clamp repair of aneurysms of the descending thoracic aorta［J］. Semin Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 10:87-90.

　　［7］Svensson LG, Crawford ES, Hess KR, et al. Experience with 1509 patients undergoing thoracoabdominal aortic operations［J］. J Vasc Surg, 1993, 17:357-370.

　　［8］Zhang P, Abraham VS, Kraft KR,et al. Hyperthermic preconditioning protects against spinal cord ischemic injury［J］. Ann Thorac Surg,2000,70:1490-1495.

　　［9］Toung TJ, Chang Y, Williams M, et al. Experimental spinal cord ischemia: model characterization and improved outcome with arterial hypertension［J］. Crit Care Med, 2004, 32:1346-1351.

　　［10］Contreras IS, Moreira LF, Ballester G, et al. Immediate ischemic preconditioning based on somatosensory evoked potentials seems to prevent spinal cord injury following descending thoracic aorta cross-clamping［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2005, 28:274-279.

　　［11］Strauch JT, Lauten A, Spielvogel D, et al. Mild hypothermia protects the spinal cord from ischemic injury in a chronic porcine model［J］. Eur J Cardiothorac Surg, 2004, 25:708-715.

　　［12］Toumpoulis IK, Papakostas JC, Matsagas MI, et al. Superiority of early relative to late ischemic preconditioning in spinal cord protection after descending thoracic aortic occlusion［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 128:724-730.

　　［13］Dong P, Guan Y, Yang J, et al. Fundus microvascular flow monitoring during retrograde cerebral perfusion: an experimental study［J］. Ann Thorac Surg, 2000, 70:1478-1482.