香菇多糖协同阿糖胞苷对HL-60白血病细胞增殖力的影响

                      作者：吴东红　王翠莲　张宇明　陈永振

【关键词】  香菇

　　摘要：目的：研究香菇多糖协同阿糖胞苷（Ara-c）对HL-60白血病细胞增殖力的影响。方法：观察HL-60细胞，分别经香菇多糖、Ara-c或香菇多糖协同Ara-c处理后，HL-60活性、抑制率及集落形成能力的变化，并与对照组（不含处理因素）比较。结果：香菇多糖协同Ara-c组HL-60细胞集落形成能力、增殖抑制率与其他三组比有显著差异，HL-60细胞活力与Ara-c组比无显著差异；香菇多糖组与对照组比各项指标均无显著差异。结论：香菇多糖能增强Ara-c对HL-60细胞的杀伤力。

　　关键词: 香菇多糖；Ara-c；HL-60；杀伤力
  
　　The Effects of Lentinan Polysaccharide and Ara-c on theAbility of HL-60 Cells Proliferation

　　Abstract： Objective:To study the effects of lentinan polysaccharide and Ara-c in the ability of proliferation on HL-60 cells. Method:Observing the activity, inhibited-rate and the colony-formation-ability of the HL-60 cells in lentinan polysaccharide-Ara-c group, lentinan polysaccharide group, Ara-c group and control group. Result: The differences in colony-formation-ability and inhibited-rate of the HL-60 cells between lentinan polysaccharide-Ara-c group and the other three groups were significant, but there is no difference in the activity when the former compared with the Ara-c group,also there is no difference between lentinan polysaccharide group and control group in each parametes. Conclusion:Lentinan polysaccharide helps to enhance the ability of Ara-c in killing the HL-60 cells.

　　Key words: Lentinan polysaccharide；Ara-c；HL-60；Killing ability
                                                                                 
　　香菇多糖作为一种重要的生物调节剂，其抗肿瘤作用愈来愈引起人们的重视， 许多研究表明，香菇多糖能改善肿瘤患者的免疫低下状态，并配合常规化疗，具有较好的辅助能力。但是, 香菇多糖抗肿瘤作用的研究多在其间接作用方面,它对肿瘤细胞直接作用的研究尚不多。本文通过香菇多糖协同阿糖胞苷（Ara-c）对HL-60白血病细胞增殖力的影响，来探讨香菇多糖对化疗药物杀肿瘤效应的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器设备：二氧化碳培养箱（SANYO MCO-15A日本）、医用净化工作台（J-875DA苏州净化设备公司）、台式低速离心机（LD5-2A北京医用离心机厂）、倒置相差显微镜（OLYMPUS IMT-I日本）。

　　1.2 药品试剂：RPMI 1640 (Gibco 公司)、淋巴细胞分离液(1.077g/mL ,上海试剂二厂) 、新生小牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(Gibco U.S.A)、四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma, U.S.A)、Ara-c (深圳万乐药业)。HL－60 细胞株（本院生化教研究传代培养）。

　　1.3 方法和步骤

　　1.3.1 HL－60 细胞培养：培养体系为RPMI 1640(含10 %小牛血清、青霉素100 U/ml,链霉素100mg/L), 置CO2培养箱内,于5％CO2、37℃,饱和湿度条件下进行传代培养，3d半量换液, 视细胞生长速度约每3天传代一次。

　　1.3.2 实验分组:①香菇多糖＋Ara-c组；②香菇多糖组；③Ara-c组；④单纯液体培养对照组。

　　1.3.3 采用台盼蓝排斥实验, 检测细胞活力, 活细胞率, 取活细胞率>95%的HL－60白血病细胞用于实验。将HL－60白血病细胞用培养液制成1×106/ml的细胞悬液，各取1ml, 分4组种于24孔培养板，平行3孔，重复2板，分别加入:①香菇多糖、Ara-c，②香菇多糖，③Ara-c，对照组：含HL－60 细胞悬液1ml(不含处理因素)。置于孵箱37℃、5%CO2继续孵育1d。 Ara-c浓度为2.75mg/L，香菇多糖浓度100mg/L参照［1,2］。

　　1.3.4 HL-60 细胞活力检测: 各孔样本混匀，行台盼蓝排斥实验,活性细胞计算公式为:活细胞率(%) = 活细胞总数×100%/(活细胞总数+死细胞总数)

　　1.3.5 MTT试验检测：每孔样本混匀，各取180ul接种于96孔培养板，每孔加入MTT(5g/L)20μl,继续培养4h,离心吸弃培养基，加入DMSO100μl，于微量振荡器上振荡20min，待紫色结晶完全溶解后，用M550型ELISA READER酶标仪测定各组细胞的A570吸光值, 计算各刺激因子对HL－60细胞的增殖抑制率(1R)。增殖抑制率(IR)＝(1-用药组A值/对照组A值)×100%。

　　1.3.6 细胞集落培养检测：按文献方法［3］进行集落半固体培养，5d观察细胞集落产出情况，计算集落总数CFU。

　　1.4 统计学处理：用SPSS 软件分析进行方差分析，P<0.05 表示差异有显著意义。

　　2 结果

　　2.1 香菇多糖＋Ara-c组及Ara-c组HL－60细胞活细胞率(%)、集落形成总数(CFU)均显著低于香菇多糖组及正常对照组；香菇多糖＋Ara-c组集落形成总数(CFU)显著低于Ara-c组，但HL－60细胞活细胞率(%)与Ara-c组比，无显著差异；香菇多糖组及正常对照组无论在HL－60细胞活细胞率(%)或集落形成总数(CFU)等方面均无显著差异。

　　表1 不同培养条件对HL－60活细胞率(%)、集落形成总数(CFU)的影响（略）

　　表2 不同培养条件对吸光度（A）及白血病细胞增殖抑制率（IR）的影响（略）

　　2.2 香菇多糖＋Ara-c组及Ara-c组白血病细胞增殖抑制率与香菇多糖组或正常对照组比均有显著性差异（P<0.01），香菇多糖＋Ara-c组白血病细胞增殖抑制率高于Ara-c组（P<0.05），香菇多糖组与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　近年来，香菇多糖的研究引起人们的重视，研究者发现，香菇多糖是一种重要的生物调节剂,尤其在抗肿瘤方面, 香菇多糖已作为一种较好的辅助药物运用于临床。就恶性肿瘤而言,多数患者伴有细胞免疫功能缺陷、免疫监控失调,另外化疗、放疗、手术等治疗手段的运用，使机体的免疫力进一步受损,导致机体免疫功能低下,香菇多糖能够提高机体的免疫力,从而间接发挥抑制肿瘤的效应。Kimura Y等人用香菇多糖与化疗药物联运用治疗初治及复发的胃癌，研究发现香菇多糖能够减少化疗副作用、提高各项免疫指标及营养指标，改善胃癌患者的免疫及营养低下状态, 并认为香菇多糖是有效安全的［4］。香菇多糖的抗肿瘤效应，可能通过以下机理起作用：通过活性因子的产生刺激辅助性T细胞的释放，提高CD4＋细胞亚群的数量及比例及T淋巴细胞的活性；促进B细胞增生并转化为浆细胞，增强体液免疫；提高巨噬细胞对活化因子的反应，诱导细胞毒效应的产生；增强NK细胞的活性，提高NK细胞对某些血清因子的反应，刺激白细胞介素、干扰素的分泌；扩增肿瘤浸润淋巴细胞并提高其活性；拮抗肿瘤细胞对T细胞转化的抑制作用等［5～7］。但总的来说，作用机制的研究仅限于间接作用方面，直接作用的研究尚不多。

　　本实验通过香菇多糖单用或与Ara-c联用，了解其对白血病细胞的影响，结果显示：香菇多糖单用对白血病细胞的影响不大，与对照组比无显著性差异，提示香菇多糖对白血病细胞的直接作用较少；与Ara-c联用时，结果显示香菇多糖能增强Ara-c对白血病细胞的增殖抑制效应，并能减弱白血病细胞的集落形成能力，提示香菇多糖能够协同Ara-c加强对白血病细胞的杀伤效应，其具体原因尚不清楚，杨江苏等人的研究显示，香菇多糖能使HL-60细胞磷酸化水平降低，影响白血病细胞的代谢而发挥抗肿瘤效应［2］；佟丽等人的报导认为茯苓多糖及刺五加多糖可致白血病细胞的膜磷脂减少，最终影响白血病细胞的代谢［8］。本文Ara-c亦是一种抗代谢药物，与香菇多糖联用，有可能加强药物对肿瘤细胞代谢的影响，从而协同发挥抗肿瘤效应，这有待以后的研究证实。

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　　［1］锦梅,徐卫红,朱泱平，等.参三醇对K562白血病细胞的抑制及增加化疗药敏感性的研究［Ｊ］. 江西中西医结合杂志，2003，13（1）：10-13．

　　［2］杨江苏，张娜，颜卉君，等.香菇多糖对HL-60细胞酪氨酸蛋白磷酸化作用的影响［Ｊ］．长治医学院学报，2000，14（2）：90-92．

　　［3］MoriyamaY,Fisher JW.Effects of testoterone and ery-thropoiet in onerythroid colony formation in human bone marrow culture［Ｊ］. Blood,1975,45:665.

　　［4］Kimura Y, Iijima S, Kato T，et al. TS-1 and lentinan combination immunochemotherapy for advanced or recurrent gastric cancer: a preliminary report［Ｊ］. Gan To Kagaku Ryoho， 2003 Oct，30(11):1791-3.

　　［5］井欢.香菇多糖对脾虚小鼠免疫功能的调节作用［Ｊ］.中医药学刊, 2003,21(11):1965-1967．

　　［6］周卫东，刘如林，邢邦华，等.深层发酵香菇水溶性胞外多糖的生物学活性［Ｊ］．菌物系统，1997，（3）：

　　［7］郭焱，郭巍，顾红樱.香菇多糖对小鼠免疫功能调节的影响［Ｊ］.微生物学杂志,2002,(4)：

　　［8］佟丽,黄添友,李吉来. 植物多糖对S180、K562细胞增殖和唾液酸、磷脂、胆固醇含量的影响［Ｊ］.中西医结合杂志,1994，(8)：