奥沙利铂对胃癌OCUM-2MD3细胞体内外杀瘤活性的实验研究

                    作者： 王力利 赵群 李勇 陈少轩 杨进强 单保恩 焦志凯

【关键词】  抗肿瘤

【摘要】 目的 观察奥沙利铂对胃癌OCUM-2MD3细胞体外的细胞毒活性，以及对胃癌腹膜移植模型的体内抗肿瘤作用。方法 与顺铂（CDDP）比较，用MTT法和药效学体内实验法分别观察奥沙利铂对胃癌OCUM-2MD3细胞的体外细胞毒活性及对胃癌腹膜移植裸鼠的体内抗肿瘤作用。结果 体外实验证明，与CDDP相比，奥沙利铂对人对胃癌OCUM-2MD3细胞的体外细胞毒活性均明显增加（P<0.01），其两者IC 50 值相比较，L-OHP IC 50

关键词 胃癌 奥沙利铂 OCUM-2MD3细胞 腹水 抗肿瘤.

【Abstract】 Objective To investigate the cytotoxicity of L-OHP in vitro，and its anti-tumor effect on OCUM-2MD3bearing nude mice in vivo.Methods The cytotoxicity in vitro byMTT assays and the anti-tumor efˉfect on OCUM-2MD3bearing naked mice in vivo by pharmacodynamic methods of L-OHP were tested respectively.Results L-OHP cells possessed a higher antitumor cytotoxic activity on OCUM-2MD3cells in vitro than cisplatin（CDDP）;Three groups of naked mice treated with L-OHP were cured（at doses of9mg/kg～2.25mg/kg，ip×3）.Conclusion L-OHP had greater cytotoxicity in vitro，had also significantly anti-tumor effects in nude mice.

Key words carcinoma of stomach L-OHP OCUM-2MD3cells ascites anti-tumor

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率居各种肿瘤之首。晚期胃癌预后差，复发转移后化疗效果不理想。多年来，5-FU一直是胃癌的首选药，但治疗胃癌的近期有效率不高，顺铂（CDDP）严重的肾毒性也限制了其临床应用，卡铂（CBP）的疗效并不优于CDDP。奥沙利铂（oxalato platinum trans-1-1，2-dia-moinocyclohexane，L-OHP）是一个第三代的新型铂类化合物，以其高效、低毒的特性脱颖而出，使胃癌化疗的有效率进一步提高。国内外研究显示奥沙利铂对大肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌等均有效，而其治疗胃癌的研究正逐渐成为热点 ［1］ 。我们通过观察奥沙利铂对胃癌腹膜移植瘤细胞株OCUM-2MD3体外的细胞毒活性，以及对胃癌腹膜移植模型的体内抗肿瘤作用，并与第一代的细胞毒广谱抗癌药CDDP比较，探讨其对晚期胃癌的化疗效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 （1）L-OHP（批号，02042812）为类白色粉末，江苏连云港制药提供，用前以无菌生理盐水配置。（2）CDDP（批号，020307）为白色粉末，山东德州制药厂生产，用前加无菌生理盐水后在50℃水浴温热助溶，配成所需浓度。

1.2 靶细胞及动物 人胃癌OCUM-2MD3腹膜移植瘤细胞株，由日本大分医科大学外一科八代正和教授惠赠，裸鼠皮下移植率100%，传代稳定。 BALB/c-nu/nu裸鼠，雌性，鼠龄4周，体重18～20g，SPF环境饲养，购于北京医科院肿瘤研究所动物中心，动物合格证:SCXK11-00-0005。

1.3 体外细胞毒活性测定 采用噻唑蓝还原法（MTT法）。取在DMEM，10%胎牛血清培养液中处于对数生长期的人胃癌OCUM-2MD3细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，用D-Hanks配成3×106 /ml癌细胞悬液，接种于96孔培养板中，180μl/孔。加入L-OHP或CDDP液（浓度分别为100、25、6.25、1.56、0.39μg/ml），20μl/孔。对照组加等体积生理盐水，空白对照组只加培养液而不加化疗药。每组设3复孔，置37℃、5%CO 2 培养箱中培养24h后，加入MTT液10μl（美国Sigma产品，用PBS液配成5mg/ml），继续培养4h后吸弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）100μl。将培养板置酶联免疫检测仪（BICELL2010全自动酶标仪）在630nm波长处测光密度值（OD值），按以下公式抑制率并求出IC 50 值。抑制率（%）=（对照组平均OD值-实验组平均OD值对照组平均OD值-空白对照组平均OD值）×100%

1.4 L-OHP对胃癌腹膜移植模型裸鼠的抑瘤实验 本文在预实验中证实，当每只裸鼠接种OCUM-2MD3细胞数为5×10 6 时，肿瘤发生率为100%。48只裸鼠，腹腔注射生长良好的胃癌OCUM-2MD3细胞株（5×10 6 /0.2ml），建立腹膜种植模型。随机分6组，即正常对照组（不接种瘤细胞）4.5mg/kg、NS对照组、CDDP组（4.5mg/kg）、L-OHP组（不同浓度9mg/kg、4.5mg/kg、2.25mg/kg）。于接种后15天腹腔给药（隔日一次，共3次），观察记录动物存活情况，以接种瘤细胞后生存35天为治愈标准。组间存活时间的差异显著性以t检验进行。体内药效试验在同一条件下进行3次。

2 结果

2.1 体外细胞毒活性测定 见表1。本结果显示，L-OHP 与CDDP相比，对胃癌OCUM-2MD3细胞的体外细胞毒活性均明显增加（P<0.01）;其两者IC 50 值相比较，L-OHP IC 50

表1 不同浓度L-OHP、CDDP干预胃癌细胞后细胞毒活性的变化

注:与CDDP组比较 ˇ P<0.01

2.2 L-OHP、CDDP对裸鼠胃癌细胞腹膜移植模型的干预 见表2。本研究对胃癌腹膜移植模的体内抗肿瘤作用的试验结果显示，与NS对照组相比，L-OHP、CDDP对胃癌细胞腹膜种植转移模型裸鼠后其各组生存期明显延长，腹围明显减小，腹水均消退（P<0.01）;与正常对照组 相比，上述指标无明显差异。表明L-OHP三组剂量对裸鼠胃癌细胞腹膜种植转移模型均有较强的抗肿瘤作用，其腹腔注射对胃癌晚期具有很强的消腹水作用，其最低剂量优于CDDP中剂量的效果。

表2 L-OHP、CDDP对裸鼠胃癌细胞腹膜移植模型的干预 （ˉx±s）

注:与NS组比较 ˇ P<0.01

3 讨论

铂类络合物的抗肿瘤活性的研究始于20世纪60年代，奥沙利铂是此类衍生物中较为理想的化合物，是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗癌药 ［2］ ，首先于70年代末由日本的Kidani合成，化学名为左旋反式二氨环己烷草酸铂。该药水溶性是顺铂的8倍，是一极为稳定的络合物。它的药特性与其它铂类药物相似，均以DNA为靶点，易与DNA链上的G共价结合，并可能形成链内交联、链间交联及DNA蛋白质交联，使DNA损伤，破坏DNA复制，造成细胞毒性作用，使细胞死亡 ［3］ 。奥沙利铂的化学结构与顺铂不同，顺铂氨基被1，2-环己熔基锘团（DACH）代替。DACH-铂复合体抑制DNA作用更加强烈，与DNA结合速率快10倍以上，且结合牢固，故其阻断DNA复制和转录的作用更加强烈。在体外及活体内的临床前研究表明，对结肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、中枢神经系统癌以及白血病细胞系的细胞毒作用明显高于顺铂;对于前列腺癌和黑色素瘤细胞的体外瘤活性与顺铂接近，对耐顺铂细胞系A2789/CP和L1210/DDP均显示抑瘤作用，表明奥沙利铂与顺铂之间无交叉耐药性，并且毒性低于顺铂。奥沙利铂破坏DNA的结构和功能与阻碍DNA合成的5-FU联合形成 互补抑制的协同效果，而且对5-FU耐药的肿瘤仍有效 ［4～6］ 。奥沙利铂的这些特点使研究者们对其进行了广泛而深入的研究。

本研究体外细胞毒试验结果表明，浓度分别为100、25、6.25、1.56、0.39μg/ml的L-OHP与CDDP相比较，对胃癌OCUM-2MD3细胞的体外细胞毒活性均明显增加（P<0.01）;其二者IC50 值相比较，L-OHP IC 50

1 Eriguchi M，Osada I，Fujii Y，et al.Pilot study for preoperative adminisˉtration of L-OHP to patients with advanced scirrhous type gastric canˉcer.Biomed Pharmacother，1997，51（5）:217-220.

2 Y，Segiguxhi M.Oxalatoplatinum or L-OHP，a third-generation platˉinum complex:an experimental and clinical appraisable and preliminary comparison with cis-platinum and carboplatinum.Biomed&Pharmaˉcother，1989，43:237-250.

3 林万隆.奥沙利铂的药理作用及临床应用.肿瘤临床，2000，27（11）:872-874.

4 王艳荣，张芳.运用奥沙利铂联合化疗治疗大肠癌的观察及护理.护理，2001，7（10）:39.

5 罗丽莹，吕韶敏，刘文超.奥沙利铂联合氟尿嘧啶四氢叶酸治疗胃肠道恶性肿瘤43例.第四军医大学学报，2002，23（5）:475.

6 万以叶.草酸铂联合氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸治疗晚期大肠癌的疗效观察.中国癌症杂志，2001，11（6）:566.