促红细胞生成素在中枢神经系统中的作用
【关键词】 生成素
促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是组织氧合状态的一种主要决定因素，EPO通过结合细胞表面的特异性受体（EPO-R）而发挥作用，以往认为EPO特异而专一地作用于造血细胞，但目前认识到EPO对其他细胞也有作用，功能性EPO-R除存在于造血系统外，还存在于各种非造血系统，如中枢神经系统（CNS）。本文对EPO及EPO-R在CNS中的作用做一综述。
1 EPO和EPO-R的分子结构及其在CNS的分布
1.1 EPO和EPO-R的分子结构 人类EPO基因定位于7q 11-12 ，含5个外显子和4个内含子，其序列在哺乳动物种族（人、鼠、猪、绵羊）间有80%～82%同源性。EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，由193个氨基酸序列合成，经过转化其活性蛋白为165个氨基酸，随后被高度糖基化。天然存在的EPO有α和β两种亚型，两者的主要区别在于碳水化合物含量不同，而生物学特性和抗原性相同。重组人促红细胞生成素（rHu-EPO）是一种通过基因重组DNA技术生产的、含有与天然分离的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，生物学活性也相似。目前已知CNS存在脑源性EPO，其分子量（33kD）较血清EPO（35kD）为小，可能因其唾液酸基较小之故，但作用却比血清EPO为强。EPO合成释放受制于多种因素的调节，组织缺氧是主要的刺激因素。细胞内不贮存EPO，仅在需要时通过增加mRNA的合成而产生。EPO是一种存活因子，具有抑制细胞凋亡、减少正常细胞丢失的功能，为多种细胞的存活所必需。EPO必须通过EPO-R才能发挥其功能。EPO-R基因定位于19p 13.3 ，属细胞因子受体超家族中造血生长因子受体家族成员，是一种含508个氨基酸的单链跨膜糖蛋白，其胞浆区中boxl、box2为保守区，为促进有丝分裂与诱导酪氨酸磷酸化配基偶联所必需，胞浆近膜区部分为与JAK2作用所必需。
1.2 EPO和EPO-R在CNS中的分布 研究已经证实CNS存在EPO。目前，在人类大脑皮质、海马及恒河猴的许多脑部区域可以检测到EPO-R，而且在CNS损伤时，临床患者的脑脊液中也可以检测到EPO蛋白的变化。Dame ［1］ 等对孕龄23～37周的早产死亡胎儿的CNS内7个解剖部位进行EPO的mRNA定量分析，其中小脑最多，随后依次为垂体、大脑皮质、杏仁核、海马及基底核，仅有微量的EPOmRˉNA在脊髓中表达。Juul ［2］ 等的研究发现，在胚胎发育期间，EPO与EPO-R的mRNA及蛋白产物可以在人类大脑及脊髓的神经元、神经胶质细胞中表达，星形胶质细胞和神经元的原代培养都显示可以产生EPO。Poveshchenko ［3］ 等对不同年龄组Balb/c小鼠的大脑半球EPO-RmRNA检测发现，EPO-R不仅存在于发育中的CNS，从新生鼠到老年鼠的大脑半球均有其表达产物存在，老龄鼠表达产物最高，左侧半球表达要高于右侧半球.早先学者认为，EPO作为一种
巨大糖蛋白不能通过血脑屏障，静脉注射rHu-EPO不会引起脑脊液中EPO含量的增加。Marti ［4］ 等研究认为，EPO直接起源于大脑，在缺乏明显损害时，产生于肾脏的EPO不会穿越血脑屏障。然而，最新研究表明，EPO可能是一种能被选择性转运的大分子物质。研究者利用生物素标记的rHu-EPO静脉注射于实验动物，5h后可以观察到rHu-EPO存在于微血管周围并进入脑实质，大量非标记rHu-EPO的联合注入明显减少了标记的rHu-EPO数量，符合一种特殊的可饱和转运机制 ［5］ 。另有观点认为，EPO可以透过受损伤的血脑屏障。有研究报道，局部脑缺血之前或脑缺血6h内静脉给予EPO-α，可以明显减少损伤面积，静脉注射EPO可以发挥其对CNS的保护作用。目前，就EPO能否透过血脑屏障仍有不同观点，但大多数研究认为EPO可以透过血脑屏障。
2 EPO和EPO-R对神经干细胞及血管内皮细胞的作用
神经干细胞对CNS损伤后的修复作用己逐渐被人们所认识。研究发现:在成人脑室下区和神经发生期间的胚胎生发区都可以产生EPO-R。有研究者通过半定量PCR，观察EPO与EPO-R在胎儿脑和脊髓中的变化发现，脊髓EPO和EPO-R在妊娠7～16周没有明显增加，而胎脑中EPO与EPO-R在妊娠8～24周时增加 ［2］ 。目前已证实在胎脑中有高水平的EPO-R，表明EPO对大脑的早期发育有重要影响。来自胎脑的神经干细胞，可以在遗传和非遗传因素作用下向神经前体细胞分化，而有关研究表明，EPO可以对神经干细胞增殖和分化产生调控作用。Shingo等 ［6］ 研究显示，将EPO注入成体侧脑室，可导致脑室下区神经干细胞的数量减少和迁往嗅球的新生细胞增加，及嗅球部新生中间神经元增加，注入EPO抗体则有相反的结果。EPO可能是一种自分泌-旁分泌因子，通过前脑区神经干细胞来调节神经前体细胞的生成量。有人将EPO加或不加入培养基在20%氧环境中培养中脑神经前体细胞，可以观察到加了EPO组，细胞增殖加强，凋亡减少，产生的多巴胺能神经元明显增加。这些研究表明，EPO可以促进神经前体细胞向成熟神经元分化。
Angnostou等 ［7］ 已经证明内皮细胞上有红细胞生成素受体，一些研究表明rHuEPO与血管内皮相互作用。Carlinˉi ［8］ 等研究表明，在体外rHuEPO增加神经血管的形成。吴岩等 ［9］ 研究发现，rHuEPO可以抑制脂多糖诱导的内皮细胞凋亡。Marti ［10］ 等发现，EPO还可以促进缺血区域的血管增生，在缺血部位建立侧支循环，从而起到间接保护神经的作用。Bernauctin等 ［11］ 证实在缺血后第一天病灶内皮细胞有EPOmRNA表达。以上研究表明，EPO能促进血管内皮细胞增殖和新生血管形成。
3 EPO和EPO-R对神经细胞凋亡或坏死的抑制作用
众所周知，细胞死亡有细胞凋亡和炎性坏死之分。业已证实EPO可以在缺氧时促进神经元的存活。其作用体现在两方面:一方面，EPO对缺血神经元具有很强的抗凋亡作用。在动物实验中发现大鼠在缺血前后给予EPO能减少海马和皮层神经元的死亡。Siren等 ［12］ 对大鼠脑梗死组织切片进行末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸尾标记（TUNEL）发现，EPO使局部缺血半影区内的阳性标记凋亡神经元明显减少，甚至消失。Celik等 ［13］ 报道，正常脊髓前角运动神经元大量表达EPO-R，静脉注射rHuEPO可使缺血诱导的运动神经元凋亡减少，神经功能丧失减轻。对照组（生理盐水）脊髓前角运动神经元可见TUNEL标记，而rHuEPO处理组则否，表明EPO可以阻止缺血诱导的神经元凋亡。体外实验也证明EPO具有抗凋亡作用 ［12］ 。Morishita ［14］ 将培养的鼠胚海马和皮层神经置于谷氨酸15min后再培养24h，发现在置于谷氨酸前8h经EPO处理的细胞存活数增加，而应用可溶性EPO抗体的细胞则明显减少。另一方面，EPO具有明显的抗炎作用。Sela等 ［15］ 经多种方法证实，血液透析患者多型核白细胞的胞膜上有EPO-R，还发现EPO能抑制多型核白细胞的致炎反应;发现应用EPO后6个月，患者体内的致炎因子、肿瘤坏死因子（TNF）减少、抗炎因子白介素-10（IL-10）增多。更直接的证据是给实验诱发的自身免疫性脑膜炎大鼠注射EPO后，脑膜炎症状明显改善 ［15］ 。由上可见，EPO对神经元的保护作用可能与其抗凋亡和抗炎作用有关。
4 EPO对CNS的保护机制
实验证明神经细胞可产生内源性EPO，以旁分泌的方式发挥保护作用。各种原因造成的CNS损伤可促使EPO的分泌，EPO通过与EPO-R结合启动信号传导通路。实验研究提出几种可能的受体后保护机制。
4.1 激活酪氨酸激酶Janus激酶2（Jak2） Janus激酶2（Jak2）在EPO的信号传导中起着关键的作用。Parganas ［16］ 发现Jak2基因缺陷小鼠因红细胞生成障碍而死于胚胎期，即使应用EPO也不能改变结局。目前认为Jak2先与EPO-R结合，EPO与EPO-R的结合后造成EPO-R二聚化，导致Jak2与EPO-R的结合亲和力提高，自身激活位点被磷酸化而自我激活。激活的Jak2引发了酪氨酸磷酸化瀑布，使EPO-R的酪氨酸残基和胞浆内多个蛋白如P13K、STAT5、Shpl等酸磷酸化而相继被激活，产生一系列效应。
4.2 激活磷酯酰肌醇-3激酶（phosphoinstide3-kinae，P13K） P13K由P110催化亚基和P85调节亚基组成。当EPO与EPO-R结合激活Jak2及EPO-R后，含有SH2结构的P85亚基与EPO-R的酪氨酸 479 （Tyr 479 ）结合而激活，激活的P13K将其底物磷酯酰肌醇-4-磷酸（PIP）和磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）的3-OH磷酸化生成肌醇-3，4-二磷酸（1P2）和肌醇-3，4，5-三磷酸（1P3），后者可在磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDKl）和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2（PDK2）参与下激活蛋白激酶B（PKB，又称Akt）。PKB介导多种生物学效应，是最重要的抗凋亡调节因子，其机制可能如下:（1）促使凋亡相关因子如半胱天冬酶caspase-3和caspase-9磷酸化而失活，抑制其促凋亡作用。（2）磷酸化核因子kB（NFkB）的抑制酶IkBa（1kappaBalpha），使NFkB能够进入核内调节抗凋亡基因的转录。（3）抑制糖原合成酶激酶-3（GSK3）活性。使GSK3失活而阻止凋亡发生。（4）引起Forkead转录因子成员FKHRL-1蛋白磷酸化，使其与磷酸丝氨酸结合蛋白14-3-3结合留于胞浆 内，不能进入核内编码FasL（CD95配基）基因表达从而抑制凋亡。（5）防止线粒体释放凋亡因子。线粒体可释放细胞色素C及凋亡诱导因子，PKB可阻止其释放从而起到防止细胞凋亡的作用。
4.3 激活信号传导和转录活化因子（STAT） STAT在细胞生存和增殖方面起着重要的媒介作用。EPO主要激活其成员STAT5。Jak2激活后使STAT5酪氨酸磷酸化，随后STAT5定位于EPO-R酪氨酸残基Tyr 343 或Tyr 401 后被激活，激活的STAT5与EPO-R脱离形成二聚体，然后转入核内绑缚到DNA的特定调节序列，如BcI-X/L，β-casein、p21 WAFI 、CIS、cyclin、Dl、c-fos等，激活目的基因的转录。虽然Jak2/STAT5通路大部分研究集中在红系祖细胞中，但近来的研究表明该通路也存在于CNS。故Jak2/STAT5通路也可能参与了神经细胞的缺血脑保护。
4.4 抑制兴奋性氨基酸的毒性作用 兴奋性氨基酸在各种脑损伤，特别是缺血性脑损伤的发病机制中起重要作用。Kawakami ［17］ 经研究发现，EPO能使钙离子诱导的培养小脑粒细胞神经元的谷氨酸释放受抑制，使神经元的死亡减轻;EPO-R的合成肽拮抗剂EMPI（EPO mimeticpeptide1）可通过抑制谷氨酸的胞吐作用而产生类似效应;但以上作用都可被酪氨酸激酶抑制剂genistein所消除。由于EPO和EMˉPl都可激活与EPO-R相连的Jak2。因此推测EPO减少神经元死亡的作用是通过激活EPO-R和Jak2，从而抑制谷氨酸释放这一机制实现的。
4.5 其他机制 钙离子内流及EPO-R的负调节机制都可能参与了EPO对CNS的保护作用。Koshimura ［18］ 发现EPO增加了PC12细胞钙离子的摄取，使细胞内浓度增高;同时多巴胺的释放增多，酪氨酸羟化酶活性增强，无血清和神经生长因子培养条件下的细胞存活数增多，这些作用可被钙离子拮抗剂尼卡地平和抗EPO抗体所取消。提示EPO提高细胞生存能力和其它细胞功能是通过激活钙离子通道而起作用的，说明钙离子在EPO激发的信号通路中起着重要的第二信使的作用，但其具体机制尚不清楚。EPO可能通过蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine，PTP）和细胞因子信号抑制因子（SOCS）家族成员CIS（cytokine inducible SH2-containing protein）发挥负调节作用 ［19］ 。PTP随着EPO-R及Jak2的激活，被绑缚到EPO-R的酪氨酸残基及Jak2上，引起EPO-R的构像的改变和Jak2的去磷酸化而使之失活，从而抑制其它信号分子的继续激活。CIS的调节属细胞因子信号传导中经典的反馈调节，EPO激活Jak2/STAS5，STAS5二聚体进入核内，促使CIS基因的转录，合成的CIS则与EPO-R结合使之灭活，从而中止其它信号因子的激活。另外，在CNS损伤后EPO信号传导中，还可能激活了Ras/MAKS通路，但该通路在脑保护中起何种作用仍不明确。
5 EPO对神经系统疾病的临床应用前景
综上所述，人的CNS内有低水平EPO表达，EPO在脑内起着旁分泌的作用，通过与EPO-R结合对各种原因所致的神经元死亡呈现保护作用。鉴于许多研究证实，EPO可以被缺氧诱导，可以通过多种途径减少缺血后神经元的损伤，在缺氧/缺血时，EPO对CNS具有明显的保护作用，因此有人提出外源性EPO可作为神经保护剂应用于脑卒中或其他脑损伤的。已有证据证明，动物经用EPO预处理后，由缺血或神经毒性刺激生成的自由基及一氧化氮（NO）所致的神经元变性减轻。Genc等 ［20］ 的研究显示，EPO对培养的星型胶质细胞谷胱苷肽过氧化物酶的生成具有刺激效应，认为此可能是其对MPTP诱导的帕金森综合征模型具有治疗作用的机制之一。因而，EPO有可能用于治疗帕金森综合征等神经变性疾病。Catania等 ［21］ 经动物实验表明，在脑缺血时，rHu-EPO的神经保护效果与学习功能保存相联系;Sakanaka等 ［22］ 应用沙土鼠前脑缺血模型，在缺血后3min连续7天将rEPO注入侧脑室，结果发现可阻止缺血诱导的认知能力丧失;肾衰透析患者用EPO治疗后，学习和记忆、持续的注意力等认知功能随着血细胞压积的回升而提高，脑的事件相关电位（如P3幅度增加）等电生理实验也证明脑功能有改善。因此，EPO能否用于治疗痴呆的认知功能障碍，具有重要的实际应用价值，已成为当前颇受关注的研究热点。相信随着研究的不断深入，可望对EPO在CNS中的保护作用有更全面的认识。而研究结果一旦能应用于临床，无疑将造福于人类健康。
1 Dame C，Bartmann P，Wolber E，et al.Erythropoietin gene expression in different areas of the developing human central nervous system.Brain Res Dev BrainRes，2000，125:69-74.
2 Juul SE，Anderson DK，Li Y.Erythropoietin and erythropoietin receptor in the developing human central nervous system.Pediatr Res，1998，43:40-49.
3 Poveshchenko AF，Filimonov PN，Abramov VV，et al.Expression of eryˉthropoietin receptor mRNA in mouse brain hemispheres，2001，43:279-283.
4 Marti HH，Gassmann M，Wenger RH.Deteetion of erythropoietin in huˉman liquor:intrinsic erythropoietin production in the brain.Kidney Int，1997，51:416-418.
5 Brines M，Ghezzi P，Keenan S，et al.Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:10526-10531.
6 Shingo T，Sorokan ST，Shimazaki T，et al.Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian foreˉbrain neural stem cells.Neurosci，2001，21:9733-9743.
7 Anagnostou A，Liu Z，Steiner M，et al.Erythropoietin receptor mRNA expression in human endothelial cells.Natl Acad Sci USA，1994，91:3974-3978.
8 Carlini RG，Reyes AA，Rothstein M.Recombinant human erythropoietin stimulates angiogenesis in vitro.Kindey Int，1995，47:740-745.
9 吴岩，陈友琴，龚丽，等.重组人促红细胞生成素抑制内皮细胞 凋亡的实验研究.医学物杂志，2001，18（3）:185-186.
10 Marti HH，Bernaudin M，Petit E，et al.Neuroproteetion and Angiogeneˉsis:Dual Role of Erythropoietin in Brain Ischemia.
News Physiol Sci，2000，15:225-229.
11 Bernaudin M，Marti HH，Roussel S，et al.Potential role for erythropoiˉetin in focal permanent cerebral ischemia in mice.Cereb Blood Flow Metab，1999，19（6）:643-651.
12 Siren AL，Fratelli M，Brines M，et al.Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress.NatlAcadSci USA，2001，98（7）:4044-4049.
13 Gelik M，Gokmen N，Erbayraktar S，et al.Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury.Natl Acad Sci USA，2002，99:2258-2263.
14 Morishita E，Masuda S，Nagao M，et al.Erythropoietin receptor is exˉpression in rat hippocampal and cerebral cortical neurons，and erythroˉpoietin prevents in vitro glutamate-induced neuronal death.Neuroˉscience，1997，76（1）:105-116.
15 Sela S，Shurtz-Swirski R，Sharon R，et al.The polymorphonuclear leukocytea new target for erythropoietin.Nephron，2001，88（3）:205-210.
16 Parganas E，Wang D，Stravopodis D，et al.Jak2is essential for signalˉing through a variety of cytokine receptors.Ihle JN Cell，1998，93（3）:385-395.
17 Kawakami M，Sekiguchi M，Sato K，et al.Erythropoietin receptor-meˉdiated inhibition of exocytotic glutamate release confers neuroprotection during chemical ischemia.Biol Chem，2001，276（42）:39469-39475.
18 Koshimura K，Murakami Y，Sohmiya M，et al.Effects of erythropoietin on neuronal activity.Neurochem，1999，72（6）:2565-2572.
19 Hortner M，Nielsch U，Mayr LM，et al.A new high affinity binding site for suppressor of cytokine signaling-3on the erythropoietin receptor.Eur Biochem，2002，269（10）:2516-2526.
20 Genc S，Akhisaroglu M，Kuralay F，et al.Erythropoietin restores gluˉtathione peroxidase activity in1-methyl-4phenyl-l，2，5，6-teˉtrahydropyridine-induced neurotoxieity in C57BL mice and stimulates murine astroglial glutathione peroxidase production in vitro.Neurosci Lett，2002，321:73-76.
21 Catania MA，Marciano MC，Parisi A，et al.Erythropoietin prevebts cognition impairment induced by transient brain ischemia in gerbils.Eur Pharmacol，2002，437:147-150.
22 Sakanaka M，Wen TC，Maatsuda S，et al.In vivo evidence that erythroˉpoietin protects neurons from ischemicdamage.Proc Natl AcadSci USA，1998，95（8）:4635-4640.
